Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol.
5 No.
April 2013 UJI AKTIVITAS ANTIFUNGI EKSTRAK DAUN SIRIH (Piper betle L) TERHADAP Saprolegnia sp SECARA IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITIES TEST OF BETEL LEAF EXTRACT (Piper betle L) ON Saprolegnia sp.
BY IN VITRO
Rahayu Kusdarwati.
Pustika Murtinintias dan Dewa Ketut Meles Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp.
Abstract Saprolegniasis is a mycotic disease caused by Saprolegnia sp.
that usually attacking wild fish and farming fish.
Saprolegnia sp.
cause a lot of harm in process of the fish cultivation.
Prevention and treatment of the common practice is use chemical drugs, but the use of these chemicals tend to be environmentally unfriendly and there are has karsinogenik effect.
Therefore, the use of traditional medicines is one of alternative to control Saprolegnia sp.
safer than chemical drugs.
Green betel leaf contains phenolic compounds and tannins are efficacious as antifungal agent.
This study aims to prove the antifungal activity of extracts of betel leaf (Piper betle L) for Saprolegnia , and to know the minimum concentration of betel leaf extract (Piper betle L) as antifungal for Saprolegnia sp.
The design of this experiment is used completely randomized design (CRD) with 11 treatments and 3 replications.
This study used the dilution method through the Minimum Inhibitory Concentration determination (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC).
The concentration of the extract used was 50% .
5 g/m.
, 25% .
25 g/m.
, 12.
5% .
125 g/m.
, 6.
25% .
0625 g/m.
, 3.
0313 g/m.
, 1.
56% .
0156 g/m.
, 0.
78% .
0078 g/m.
, 0.
39% .
0039 g/m.
, 0.
2% .
002 g/m.
of betel leaf extract.
A positive control containing 2 ml of 3% hydrogen peroxide were added fungal suspension until 4 ml Negative control containing 2 ml of 10% DMSO were added fungal suspension until 4 ml.
The main parameters in this study is the value of optical density (OD) for MIC (Minimum Inhibitory Concentratio.
test and the absence of Saprolegnia sp.
growing on SDA media for MFC (Minimum Fungicidal Concentratio.
20% .
002g/m.
concentration of of betel leaf extract is the minimum concentration that can inhibit the growth of Saprolegnia sp.
MFC test results showed concentrations of 78% .
0078 g/m.
betel leaf extract is the minimum concentration that can kill Saprolegnia sp.
Keywords : betel leaf.
Saprolegnia sp.
, antifungal Pendahuluan Saprolegnia sp.
merupakan penyebab menyebabkan kerugian pada proses budidaya Upaya pencegahan dan pengobatan yang lazim dilakukan pada ikan-ikan yang terkena penyakit mikotik adalah menggunakan obatobatan kimia seperti malachite green, formalin, hydrogen peroxida, dan sebagainya.
Akan tetapi penggunaan bahan kimia cenderung tidak ramah lingkungan dan ada yang bersifat karsinogenik (Mayer, 2.
Oleh karena itu, pemakaian obat-obatan tradisional merupakan salah satu alternatif pengendalian Saprolegnia sp.
lebih aman.
Daun sirih hijau mengandung beberapa komponen berkhasiat, dua diantaranya yang bersifat fungisida adalah kavikol dan karvakrol (Heyne, 1.
selain itu Rahmah dan Aditya .
menyatakan bahwa senyawa fenolik dan tannin pada ekstrak daun sirih bersifat antifungi.
Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas daun sirih sebagai antifungi terhadap Saprolegnia sp.
secara in vitro.
Tujuan penelitian sebagai berikut :
Untuk membuktikan ekstrak daun sirih (Piper betle L) mempunyai aktivitas sebagai antifungi terhadap Saprolegnia sp.
Untuk mengetahui konsentrasi minimum ekstrak daun sirih (Piper betle L) sebagai antifungi terhadap Saprolegnia Manfaat dari riset ini adalah memberikan informasi mengenai aktivitas ekstrak daun sirih (Piper betle L) sebagai antifungi terhadap Saprolegnia sp, serta memberikan informasi tentang konsentrasi minimum ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang dapat dipergunakan sebagai antifungi terhadap Saprolegnia sp.
secara in vitro.
Uji Aktivitas Antifungi Ekstrak.
Metodologi Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian Laboratorium Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga pada bulan November sampai Desember 2012.
Pembuatan ekstrak daun sirih dilakukan di Unit Layanan Pengujian Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya.
Metode penelitian Rancangan Percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 11 perlakuan dan 3 kali ulangan.
Penelitian pengenceran .
ilution method.
melalui penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM).
Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 50% .
,5 gram/m.
, 25% .
,25 gram/m.
, 12,5% .
,125gram/m.
, 6,25% .
,0625 gram/m.
, 3,13% .
,0313 gram/m.
, 1,56% .
,0156 gram/m.
, 0,78% .
,0078 gram/m.
, 0,39% .
,0039 gram/m.
, 0,2% .
,002 gram/m.
dari ekstrak daun sirih.
Kontrol positif berisi 2 ml hydrogen peroksida 3% yang ditambah suspensi fungi sampai 4 ml.
Kontrol negatif berisi 2 ml DMSO 10% yang ditambah suspensi fungi sampai 4 ml.
Prosedur penelitian Sterilisasi Alat dan Bahan Semua peralatan dan bahan yang dipakai dalam penelitian ini disterilisasi untuk mematikan semua mikroorganisme yang hidup agar tidak terjadi kontaminasi.
autoclave dengan suhu 1210C dan tekanan udara 1,5 atm selama 15 Ekstraksi Daun Sirih Daun sirih didapatkan dari Nganjuk dan dipilih daun yang berukuran 7-8 cm dan berwarna hijau segar.
1,5 daun sirih yang telah didapatkan dicuci kemudian diangin-anginkan hingga kering lalu digiling.
500 gram serbuk daun sirih tersebut kemudian direndam dalam larutan n-hexane selama 5 hari untuk menghilangkan klorofil yang terkandung Ekstraksi dilakukan dengan memaserasi serbuk daun sirih dengan etanol 95% selama 3 x 24 jam dan selanjutnya disaring menggunakan kertas saring.
Hasil penyaringan diuapkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 700C dan menghasilkan 39 gram ekstrak daun sirih.
Hasil ekstraksi berbentuk kental, berwarna coklat tua dan beraroma khas minyak atsiri Kultur Saprolegnia sp.
Saprolegnia sp.
yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya diambil dengan menggunakan ose lalu ditanam pada media kultur kemudian diinkubasi pada suhu kamar .
oC) selama 48 jam.
Menurut Akbar .
, proses pemurnian dari isolat Saprolegnia sp.
dapat dilakukan lagi dengan cara mengkultur ulang fungi yang sudah tumbuh pada media SDA dengan menggunakan jarum ose steril.
Identifikasi Fungi Identifikasi memastikan fungi yang digunakan adalah benar Saprolegnia sp.
Identifikasi Saprolegnia sp.
dapat dilakukan secara makroskopis dan Pengamatan secara makroskopis dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloni dari Saprolegnia sp.
, koloni Saprolegnia berwarna putih kecoklatan dengan permukaan seperti kapas, menonjol dan bundar (Nuryati,dkk, 2.
Secara mikroskopis.
Saprolegnia sp morfologi organ reproduksi yang diamati pada kultur menggunakan media air tambak steril.
Organ reproduksi seksual dapat digunakan sebagai identifikasi terhadap Saprolegnia sp.
(Woo and Bruno, 1.
Sporangium adalah organ reproduksi aseksual Saprolegnia sp.
merupakan diferensiasi dari hifa sehingga berbentuk lebih lebar dari hifanya.
Zoospora akan dilepaskan oleh sporangium yang matang dan berenang keperairan (Yuasa, 2.
Pembuatan Larutan Zoospora Pembuatan larutan zoospora dalam penelitian ini diawali dengan menginokulasikan potongan blok agar pada bagian yang telah ditumbuhi fungi dengan ukuran 1 cm2 pada air tambak steril dalam cawan petri.
Inkubasi dilakukan selama tiga hari sampai tumbuh hifahifa disekeliling potongan blok agar.
Hifa dalam cawan petri dibilas sebanyak dua kali menggunakan air tambak steril kemudian dipindahkan dalam tabung ukur dan diinkubasi selama 24 jam.
Perhitungan jumlah zoospora Sependapat dengan Yuniar .
, yang mengatakan bahwa penghitungan jumlah sel dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali pada 9 kotak sedang Jumlah zoospora yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1,18 x 106sel/ml.
Hal ini sesuai dengan pendapat dari Yuasa dkk .
yang mengatakan bahwa jumlah zoospora yang digunakan untuk infeksi buatan adalah 105 sel/ml.
Pelaksanaan Penyiapan Ekstrak Daun Sirih Dengan Berbagai Konsentrasi Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol.
5 No.
April 2013 Pengenceran ekstrak dilakukan dengan mencampurkan ekstrak daun sirih dengan DMSO 10% hingga didapatkan konsentrasi Untuk konsentrasi 50%, 2 gram ekstrak daun sirih ditambah dengan DMSO 10% hingga 4 ml.
maka pada pengenceran maka pada konsentrasi 50% mengandung 0,5 gram ekstrak daun sirih dalam 1 ml larutan.
Pengernceran 25% didapatkan dari pengambilan 2 ml larutan dari konsentrasi 50% ditambah dengan DMSO 10% hingga 4 ml , dan seterusnya hingga konsentrasi 0,2%.
Pada konsentrasi 0,2% larutan diambil 2 ml lalu dibuang.
Kemudian setiap tabung diisi dengan suspensi fungi sebanyak 2 ml.
Kontrol positif berisi 2 ml hydrogen peroksida 3% ditambah dengan suspensi fungi hingga 4 ml, sedangkan kontrol negatif berisi 2 ml DMSO 10% ditambah dengan suspensi fungi hingga Pengenceran ekstrak daun sirih (Piper betel L) diulang sebanyak tiga kali ulangan.
Metode Pengenceran KHM merupakan konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan Pengujian KHM dilakukan dengan cara menyiapkan hasil pengenceran berseri masing-masing dari tabung nomor 1 sampai nomor 9 ditambahkan 2 ml Saprolegnia Pengamatan terhadap kekeruhan media dilakukan sebelum dan setelah inkubasi pada seluruh tabung hasil uji KHM menggunakan spectrophotometer .
anjang gelombang 615 n.
dengan membandingkan hasil selisih pengukuran setiap tabung sebelum dan sesudah Tujuan menggunakan spektrofotometer adalah untuk mengetahui nilai kekeruhan atau nilai optical density (OD) dari berbagai konsentrasi pengenceran berseri ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang telah diinokulasi Saprolegnia sp dan diinkubasi selama 48 jam.
Penentuan daya fungisidal dari ekstrak daun sirih (Piper betle L) dilakukan dengan uji KBM yaitu dengan cara menanam semua konsentrasi hasil uji KHM pada media SDA (Sabouraud Detroxe Aga.
Apabila pada media SDA terdapat pertumbuhan fungi Saprolegnia sp berarti ekstrak daun sirih (Piper betle L) pada konsentrasi tersebut tidak bersifat fungisidal.
Sedangkan apabila tidak terdapat pertumbuhan fungi Saprolegnia sp berarti ekstrak daun sirih (Piper betle L)pada konsentrasi tersebut bersifat Analisa data Data hasil penelitian uji KHM dalam penelitian ini dianalisis dengan menggunakan analisis varian (ANAVA).
Apabila perlakuan yang diberikan menunjukan pengaruh nyata maka akan dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan dengan taraf kepercayaan 95% yang bertujuan untuk mengetahui konsentrasi hambat terbaik dari ekstrak daun sirih terhadap pertumbuhan fungi Saprolegnia sp.
Data hasil uji KBM diamati dengan cara melihat ada tidaknya pertumbuhan fungi pada media SDA.
Hasil dan Pembahasan Identifikasi awal pada fungi dapat mikroskopis dan makroskopis (Ronald and Richard, 2.
Hasil pengamatan Saprolegnia sp secara makroskopis (Gambar .
pada penelitian ini sesuai dengan pendapat Nuryati .
yang mengatakan bahwa koloni Saprolegnia sp berwarna putih kecoklatan dengan permukaan seperti kapas, menonjol dan bundar.
Gambar 1.
Koloni Saprolegnia sp.
Uji Aktivitas Antifungi Ekstrak.
Gambar 2.
Organ reproduksi Saprolegnia sp secara mikroskopis dengan perbesaran 100x Keterangan: .
organ reproduksi seksual .
organ reproduksi aseksual.
: hifa, 2: sporangiu.
Pengamatan dilakukan dengan cara mengamati Saprolegnia sp diidentifikasi berdasarkan karakteristik morfologi organ reproduksi yang yang dikultur pada media air tambak steril.
Hasil pengamatan Saprolegnia sp yang dilakukan dalam penelitian ini terlihat pada Gambar 2.
Hasil pengamatan uji KHM secara visual menunjukan bahwa ekstrak daun sirih (Piper betle L) pada konsentrasi 50% dan 25 % keruh dan hampir mendekati kekeruhan pada tabung sebelum inkubasi, sedangkan pada konsentrasi 12,5% sampai dengan 0,2% lebih jernih dibandingkan dengan perlakuan sebelum Dengan menggunakan pengamatan secara visual sulit untuk membedakan tingkat kekeruhan secara pasti sehingga, dilakukan pengamatan kekeruhan dengan menggunakan spectrophotometer (Michel and Blanc, 2.
Dari hasil uji KHM dengan menggunakan spectrofotometer menunjukan bahwa selisih nilai OD berbanding lurus dengan masing-masing konsentrasi yang berarti semakin tinggi konsentrasi maka selisih nilai OD akan semakin besar (Tabel .
Pada konsentrasi 50% sampai dengan konsentrasi 0,2% menunjukan bahwa selisih nilai OD semakin rendah karena semakin sedikit ekstrak daun sirih (Piper betle L) pada masing-masing konsentrasi pengenceran Tabel 1.
Rata- rata selisih nilai OD sebelum dan setelah inkubasi
Konsentrasi
Sebelum Sesudah 2,976 1,926 1,575 0,707 12,5% 1,389 0,610 6,25% 1,082 0,619 3,12% 0,982 0,630 1,56% 0,905 0,601 0,78% 0,642 0,472 0,39% 0,605 0,466 0,20% 0,501 0,398 0,291 0,221 K0,244 Selisih
1,050
0,867
0,779
0,463
0,352
0,304
0,169
0,130
0,116
0,070
0,016
Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol.
5 No.
April 2013 Tabel 2.
Rata-rata selisih nilai OD uji KHM Konsentrasi ekstrak daun sirih (%) Rata-rata selisih nilai OD Kontrol positif .
0,070 e
0,20
0,116 de
0,39
0,130 de
0,78
0,169 de
1,56
0,304 cde
3,13
0,352 cd
6,25
0,463 c 0,779 b 0,867 ab 1,050 a Keterangan : Notasi berbeda pada kolom kedua menunjukan perbedaan yang nyata .
<0,.
Tabel 3.
Hasil KBM (Konsentrasi Bunuh Minimu.
Ekstrak daun sirih (%) 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 Keterangan :
( ) = Ada pertumbuhan fungi (-) = Tidak ada pertumbuhan fungi Berdasarkan Analisis Varian (ANAVA) perlakuan konsentrasi ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang berbeda, memberikan pengaruh nyata .
<0,.
terhadap hambatan pertumbuhan fungi Saprolegnia sp secara in vitro (Lampiran Setelah dilakukan uji jarak berganda Duncan dengan taraf kepercayaan 5% didapatkan hasil sebagai berikut (Tabel .
Konsentrasi 0,20% ekstrak daun sirih (Piper betle L) dengan nilai rata-rata OD 0,116 merupakan konsentrasi minimum yang dapat menghambat pertumbuhan Saprolegnia sp karena merupakan konsentrasi terendah yang mempunyai nilai OD tidak berbeda dengan kontrol positif yaitu dengan rata-rata 0,070.
Konsentrasi 0,2% berarti terdapat 0,002 gram ekstrak daun sirih (Piper betle L) dalam 1 ml Pengujian KBM merupakan uji lanjutan dari KHM untuk membuktikan apakah ekstrak daun sirih dapat membunuh Saprolegnia sp dengan cara menanam setiap konsentrasi pada media SDA, hasilnya disajikan pada Tabel Ulangan i Hasil KBM menunjukan bahwa pada konsentrasi 0,78% sudah tidak terdapat Saprolegnia 0,78% merupakan konsentrasi minimum ekstrak yang dapat membunuh Saprolegnia sp.
Konsentrasi 0,78% berarti terdapat 0,0078 gram ekstrak daun sirih (Piper betle L) dalam 1 ml larutan.
Pada konsentrasi 0,20% dan 0,39% terdapat Saprolegnia sp Pada kontrol positif yang berisi berisi 2 ml hydrogen peroksida 3% ditambah dengan suspensi fungi sampai 4 ml tidak terdapat pertumbuhan Saprolegnia sp, hal ini membuktikan bahwa hydrogen peroksida 3% dapat membunuh Saprolegnia sp.
Pada kontrol negatif terdapat pertumbuhan Saprolegnia sp.
Hal ini membuktikan bahwa suspensi fungi yang digunakan dalam keadaan hidup dan tidak terkontaminasi oleh bakteri atau mikroba yang Uji KHM dilakukan dengan cara pengamatan menggunakan spectrofotometer karena pengamatan secara visual sulit untuk membedakan tingkat kekeruhan pada masing- Uji Aktivitas Antifungi Ekstrak.
masing konsentrasi.
Hasil uji KHM menunjukan bahwa selisih nilai OD berbanding lurus dengan masing-masing konsentrasi ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang berarti semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih (Piper betle L) maka selisih nilai OD akan semakin besar.
Semakin rendah ekstrak daun sirih (Piper betle masing-masing pengenceran maka selisih nilai OD akan Saprolegnia sp tidak akan terhambat dengan Jawetz et al, 1996 menyatakan bahwa daya kerja antimikroba ditentukan oleh bahan antimikroba itu sendiri, semakin tinggi konsentrasi zat antimikroba tersebut maka semakin meningkat pula kemampuannya untuk bekerja sebagai pembunuh mikroba.
Hydrogen peroksida digunakan sebagai kontrol positif karena memproduksi superoksida yang merupakan ROS (Reactive Oxigen Specie.
Antioksidan merupakan penghambat ROS, akan tetapi bila keadaan tingkat ROS melebihi pertahanan antioksidan makan akan mengakibatkan kerusakan sel.
Menurut Nurswida .
, efek fungisida daun sirih disebabkan adanya komponen derivat fenol, seperti eugenol.
Mekanisme kerja senyawa fenolik melalui perusakan membran plasma, inaktivasi enzim dan denaturasi protein.
Disini fenol berkaitan dengan membran yang ergosterol akan merusak membran tersebut sehingga fungi akan mati.
Tanin yang juga terkandung dalam daun sirih segar dapat menghambat kerja enzimenzim termasuk enzim katalase (Rahmah dan Aditya, 2.
Komponen utama dinding sel fungi adalah 1-3 beta- D- glucan.
Jika enzim yang berperan dalam sinstesisnya dihambat, maka fungi tidak dapat berkembangbiak lebih lanjut (Trifena, 2.
Aktivitas antifungi tergantung dari adanya ikatan dengan sterol pada membran sel kapang atau khamir, terutama ergosterol.
Akibat terbentuknya ikatan antara sterol dengan permeabilitas membran sel sehingga sel akan kehilangan berbagai molekul kecil (Bahry dan Setiabudy 1.
Penurunan ergosterol membran sel jamur menyebabkan rusaknya permeabilitas membran, akibatnya sel jamur kehilangan intraselulernya (Aprilia, 2.
Ergosterol memainkan peran penting dalam pertumbuhan jamur dan ditemukan di membran phospholipid bilayer sel sebagian besar dalam keadaan bebas dan pada tingkat lebih rendah (Montgomery et al, 2.
Dengan demikian, penghambatan terhadap pembentukan ergosterol membran plasma sel-sel Saprolegnia sp juga berarti penghambatan terhadap reproduksinya.
Kesimpulan Berdasarkan hasil analisis dan pembahasan dalam penelitian ini, dapat disimpulkan sebagai berikut : Ekstrak daun sirih (Piper betle L) mempunyai aktivitas dalam menghambat dan membunuh pertumbuhan Saprolenia sp.
in vitro.
Konsentrasi minimum Ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang dapat menghambat pertumbuhan Saprolenia sp.
adalah 0,002 gram ekstrak daun sirih (Piper betle L) dalam 1 ml larutan .
,2%).
Konsentrasi minimum Ekstrak daun sirih (Piper betle L) yang dapat membunuh pertumbuhan Saprolenia sp.
0,0078 gram ekstrak daun sirih dalam 1 ml larutan .
,78%).
Ekstrak daun sirih (Piper betle L) dapat dipertimbangkan untuk digunakan sebagai antifungi terhadap Saprolegnia sp.
secara in Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas antifungi ekstrak daun sirih terhadap Saprolenia sp.
secara in vivo
Daftar Pustaka