Deteksi Gen firmH Pada Sampel Urin Dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Fitria Diniah Janah Sayekti* Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional.
Teknologi Laboratorium Medis diniah@stikesnas.
Mastuti Widi Lestari2 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional.
Teknologi Laboratorium Medis Mastuti.
widi@stikesnas.
Dahlan Sitohang3 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional.
Teknologi Laboratorium Medis sitohangdahlan@stikesnas.
*Corresponding author
ABSTRAK
Ginjal berperan dalam menjaga homeostatis cara membuang kelebihan H2O dan elektrolit melalui urin.
Sistem saluran urin dari individu sehat normalnya steril.
Adanya bakteri dalam sedimen urin menandakan terjadinya kontaminasi atau adanya infeksi saluran kemih.
Keberadaan mikroorganisme dalam urin dapat disebabkan juga oleh mikrorganisme yang masuk kedalam saluran kemih serta berkembang biak didalam saluran kemih tersebut.
Penyebab patogen yang paling umum adalah bakteri Escherichia coli.
Kemampuan Escherichia coli untuk menyebabkan infeksi saluran kemih yang berhubungan dengan faktor virulensi khususnya fimbrae tipe 1 dengan subunit adhesi .
imH).
Gen FirmH merupakan bagian yang paling penting dalam patogenesis infeksi saluran kemih.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen FirmH E.
coli pada sampel urin dengan metode polymerase chain reaction.
Sampel urin diperoleh dari mahasiswa yang tidak mengalami gejala penyakit apapun.
Isolasi DNA bakteri didapatkan dari sampel urin dan semua isolat DNA dapat tervisualisasi pada gel elektroforesis.
Dari pemeriksaan amplifikasi PCR dapat diketahui bahwa terdapat gen fimH yang tervisualisasi pada 164 bp pada 9 sampel yang menjadi penanda keberadaan Escherichia coli dan 1 sampel yang negatif.
Kata Kunci: FirmH.
Urin
ABSTRACT
The kidneys play a role in maintaining homeostasis by removing excess H2O and electrolytes through urine.
The urinary tract system of healthy individuals is normally sterile.
The presence of bacteria in urine sediment indicates contamination or urinary tract infection.
The presence of microorganisms in urine can also be caused by microorganisms that enter the urinary tract and multiply in the urinary tract.
The most common pathogenic cause is Escherichia coli The ability of Escherichia coli to cause urinary tract infections is associated with virulence factors, especially type 1 fimbrae with adhesion subunits (FimH).
The FirmH gene is the most important part in the pathogenesis of urinary tract This study aims to determine the presence of the E.
coli FirmH gene in urine samples using the polymerase chain reaction method.
Urine samples were obtained from students who did not experience any symptoms of the disease.
Bacterial DNA isolation was obtained from urine samples and all DNA isolates could be visualized on gel electrophoresis.
From the PCR amplification examination, it can be seen that there is a fimH gene visualized at 164 bp in 9 samples which are markers of the presence of Escherichia coli and 1 negative sample.
Keywords: FirmH.
Urine
PENDAHULUAN
Pada saluran kemih yang normal tidak ISSN : 2502-1524 Page | 198 Journal of Nursing and Health (JNH) Volume 10 Nomor 1 Maret Tahun 2025 Halaman :198 - 204 dihuni oleh bakteri aerob atau mikroba yang lain, karena urin dalam ginjal dan buliAe buli biasanya steril.
Walaupun demikian uretra bagian bawah terutama pada wanita dapat dihuni oleh bakteri yang jumlahnya makin kurang pada bagian yang mendekati kandung Escherichia coli menduduki persentasi biakan paling tinggi yaitu sekitar 50Ae90% (Perhimpunan Dokter Spesialis Penyakit Dalam Indonesia, 2.
Adanya bakteri dalam sedimen urin menandakan terjadinya kontaminasi atau adanya infeksi saluran kemih.
Penyebab patogen yang paling umum adalah bakteri Escherichia coli (Klapaczynska, 2.
Pada golongan umur tententu khususunya anak, gejala klinis ISK bervariasi, dapat berupa ISK asimtomatik hingga gejala yang berat yang dapat menimbulkan infeksi sistemik.
Oleh karena manifestasi klinis yang sangat bervariasi dan sering tidak spesifik, penyakit ini sering tidak terdeteksi hingga menyebabkan komplikasi gagal ginjal (Pardede, 2.
Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri yang dapat hidup di saluran pencernaan manusia dan hewan yang bersifat anaerob fakulatif namun dapat tumbuh pada aerob maupun anaerob (Bonkat et al.
,2.
Escherichia coli adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan diare dan termasuk dalam kelompok enterohemoragic yang dapat menimbulkan penyakit haemorrhagic colitis ditandai dengan diare berdarah.
Kemampuan Escherichia coli untuk menyebabkan infeksi saluran kemih yang berhubungan dengan faktor virulensi khususnya fimbrae tipe 1 dengan subunit adhesi (FimH).
Gen FirmH merupakan bagian yang paling penting dalam patogenesis infeksi saluran kemih.
Hal ini berhubungan dengan gejala klinis dan rencana terapi bagi penderita infeksi saluran morbiditas maupun mortalitas dari infeksi saluran kemih yang diakibatkan oleh bakteri Eschericia coli.
Salah satu metode yang ISSN : 2502-1524 dapat digunakan untuk menganalisis dan mendeteksi bakteri patogen adalah dengan menggunakan teknik Polimerase Chain Reaction (Aris et al.
, 2.
Gen fimH merupakan faktor virulensi utama pada Escherichia coli yang mengkodekan Pili tipe 1, yang merupakan faktor virulensi yang paling umum .
ekitar 80%) yang ditemukan pada Uropathogenic Escherichia coli.
Gen fimH memiliki kemampuan untuk berikatan dengan reseptor glikoprotein manomannose dan trimannose pada sel epitel saluran kemih, memungkinkan terjadinya proses kolonisasi bakteri (Kohar dkk.
, 2.
ISK ditegakkan berdasarkan biakan urin, sedangkan biakan urin baru diperoleh setelah beberapa hari kemudian, sehingga perlu mengenal manifestasi klinis sebelum diperoleh hasil biakan urin agar dapat diberikan terapi awal secara empiris.
Antibiotik sebagai terapi ISK diberikan jika ada kecurigaan terhadap ISK tanpa menunggu hasil biakan urin.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses yang berdasarkan pada reaksi enzimatik in-vitro untuk mengamplifikasi DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA oligonukleotida sebagai primer dalam sebuah Diagnostik berbasis PCR telah dikembangkan secara efektif untuk berbagai macam mikroba karena sensitivitas, spesifisitas, dan kecepatan amplifikasinya yang baik.
Primer gen FirmH yang digunakan dalam penelitian ini adalah Reverse: 5Ao-TGE-AAT AAT CGT ACC GTT GCG-3Ao.
Forward: 5Ao- GTC CCA ATT CCT CTT ACC GTT-3Ao.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional.
Alat yang digunakan yaitu: Spectrofotometer Uv-Vis, vortex, centrifuge, incubator, tabung sampel untuk kimia darah, minor set, timbangan digital, mikropipet, yellow tip, rak tabung.
Page | 199 Fitria Diniah Janah Sayekti dkk Deteksi Gen firmH Pada Sampel Urin Dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) pipet tetes.
PCR, seperangkat alat elektroforesis, waterbath, gel doc.
Bahan yang digunakan yaitu kit isolasi DNA sampel darah.
PCR mastermix, primer, alkohol pro analisis, buffer TAE, gel agarose, parafilm, alumunium foil dan Prodesur yang dilakukan yaitu isolasi DNA, uji Kualitas DNA, optimasi suhu annealing dan deteksi Gen FirmH.
Pemeriksaan gen dimulai dengan isolasi DNA bakteri dari sampel urin menggunakan kit isolasi dan purifikasi DNA (The DNA Extractio.
dari Geneaid.
Deteksi gen FirmH yaitu dengan cara fragmen DNA diamplifikasi dengan perimer spesifik.
Campuran reaksi PCR .
olume akhir 25 AAL) yang tediri dari: 2AAL primer mix .
AAL primer forward dan 1 AAL primer revers.
ke dalam microtube PCR 0,2 ml ditambahakan 15 AAL PCR master mix .
x buffer PCR, 150 nM dNTP, dan 0,5 U Taq DNA polymeras.
, kemudian ditambahkan 3 AAL Nuclease Free Water dan 5 AAL DNA Pengaturan temperatur reaksi PCR gen FirmH adalah sebagai berikut:
denaturasi awal dilakukan pada suhu 95AC selama 15 menit, annealing pada suhu 56AC selama 1menit, extension pada suhu 72AC selama 1 menit, dan final extension pada suhu 72AC selama 10 menit (Iran 2.
Produk PCR yang diperoleh dari proses PCR dengan kondisi PCR yang telah disesuaikan kemudian dielektroforesis menggunakan gel Hasil deteksi gen FirmH dianalisa secara deskriptif berdasarkan pita DNA atau band yang nampak pada gel agarose dari elektroforesis dan hasil visualisasi dengan menggunakan gel doc.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan deteksi gen FirmH yang merupakan indikator keberadaan bakteri coli dalam sampel urin.
Pengerjaan isolasi DNA diperlukan sterilitas agar ISSN : 2502-1524 didapatkan isolat DNA yang murni dan minim kontaminasi.
Untuk menghindari kontaminasi bakteri diluar saluran kemih pada saat pengambilan sampel, area genital perlu dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu antiseptik.
Sampel urin yang digunakan yaitu urin mid-stream.
Aliran urin awal membantu membersihkan bakteri dan sel-sel yang mungkin ada di uretra .
aluran kencin.
(Seputra dkk.
Pada tahap isolasi DNA didapatkan isolat DNA sebanyak 200AAl.
Hasil isolasi DNA bakteri dari sampel urin diuji secara kualitatif dan kuantitatif.
Nilai kemurnian DNA dapat ditentukan menggunakan perbandingan Optical Density (OD) larutan pada berbagai macam gelombang dengan menggunakan spektofotometer.
Tingkat kemurnian DNA dikatakan baik jika nilai rasio Optical Density (OD) 260/280 nm Berdasarkan hasil uji kuantitatif DNA penelitian dapat diketahui bahwa isolat DNA yang didapatkan berada dibawah rasio nilai ideal yang dapat dilihat pada Tabel 1.
Hal tersebut dapat disebabkan DNA Menurut Fatchiyah et al .
tingkat kemurnian diatas 2,0 menunjukkan bahwa DNA tidak murni disebabkan juga oleh adanya sisa-sisa etanol pada saat pengeringan yang tidak sempurna.
Banyak DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor pada saat ekstraksi DNA dan kondisi sampel.
Tabel 1.
Hasil uji kuantitatif isolat DNA bakteri pada urin Mahasiswa STIKES Nasional.
Sample Konsentrasi DNA .
ng/AAL ) Kemurnian DNA.
bs260/abs.
Page | 200 Journal of Nursing and Health (JNH) Volume 10 Nomor 1 Maret Tahun 2025 Halaman :198 - 204 Nl0 Isolat DNA yang telah diperoleh kemudian dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan elektroforesis.
Uji kualitatif konsentrasi 1,5% pada chamber yang berisi TBE 1X.
Secara umum, sampel isolat DNA yang digunakan dalam uji kualitatif dapat menghasilkan pita DNA.
Namun, pita DNA hasil elektroforesis yang diperoleh menunjukkan variasi pita DNA yang tebal dan tipis.
Pita DNA yang tipis menunjukkan konsentrasi DNA yang paling sedikit jika dibandingkan dengan sampel lainnya.
Menurut Komalasari .
dapat diketahui bahwa konsentrasi hasil ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis buffer.
Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling berpengaruh karena pada tahap lisis supernatant harus dilakukan persampel, pengendapan DNA Pita DNA yang tebal dan mengumpul .
idak menyeba.
seharusnya menunjukan konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi utuh (Aulia et al, 2.
Pita DNA yang terlihat menyebar menunjukan adanya ikatan antar molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung, sehingga DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil (Puspitaningrum, & Solihin.
ISSN : 2502-1524 Gambar 1.
Hasil Visualisasi Uji Kualitas DNA menggunakan Elektroforesis Gel Agarose Isolat DNA dilakukan uji optimasi menggunakan PCR Gradien untuk mendapatkan suhu annealing optimal.
Hasil optimasi suhu annealing dapat dilihat pada gambar 2.
Suhu annealing yang optimal yaitu 56,1AC pada primer yang digunakan.
Gambar 2.
Hasil optimasi suhu annealing dengan metode PCR Gradien Setelah didapatkan suhu annealing optimal, dilakukan amplifikasi dengan menggunakan PCR.
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi memperbanyak fragmen DNA spesifik.
Siklus yang bekerja antara lain denaturasi .
emutusan DNA penempelan .
primer spesifik, dan pemanjangan .
oleh enzim DNA polimerase untuk memperbanyak target DNA.
Hasil amplifikasi PCR dapat diamati dengan elektroforesis gel agaros yang tervisualisasi menggunakan GelDoc.
Hasil dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar.
Hasil Visualisasi deteksi gen FirmH (Target gen 164 b.
Page | 201 Fitria Diniah Janah Sayekti dkk Deteksi Gen firmH Pada Sampel Urin Dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen fimH Escherichia coli pada penelitian ini ditemukan pada 9 sampel urin dari responden yang tidak memiliki gejala penyakit yang berhubungan dengan ISK dan negatif pada satu sampel.
Dalam keadaan normal saluran kemih tidak mikroorganisme lainnya.
Namun E.
bisa menjadi bagian dari flora normal dalam situasi tertentu.
coli yang ditemukan dalam sampel responden tanpa keluhan mungkin berasal dari translokasi bakteri dari usus ke darah atau cairan tubuh lainnya, yang dapat terjadi pada individu dengan sistem imun yang terganggu atau setelah prosedur medis Escherichia coli merupakan bakteri yang paling banyak ditemukan pada kasus infeksi saluran kemih yaitu 80-90%.
Faktor virulensi yang berperan penting dari E.
coli penyebab ISK adalah fimbrae tipe 1 yang merupakan faktor virulensi terbanyak pada kejadian infeksi saluran kemih (Schreiber et al.
, 2.
Fimbriae tipe 1 adalah struktur permukaan seperti rambut yang memungkinkan bakteri untuk menempel pada sel inang dan permukaan Fimbriae tipe 1 terdiri dari proteinprotein yang disusun dalam bentuk heliks, dengan adhesin .
rotein pengika.
di Adhesi yang dimediasi oleh fimbriae tipe 1 adalah langkah awal yang penting dalam kolonisasi dan infeksi.
Pada infeksi saluran kemih (ISK), fimbriae tipe 1 memungkinkan E.
Coli untuk menempel pada sel-sel epitel uroepitelial, membantu bakteri bertahan terhadap aliran urine dan memulai proses infeksi.
Fimbriae tipe 1
berperan dalam pembentukan biofilm, yaitu komunitas mikroba yang melekat pada permukaan dan terbungkus dalam Biofilm
memberikan perlindungan tambahan bagi bakteri darilingkungan eksternal dan agen
Protein
ISSN : 2502-1524
membentuk fimbriae tipe 1 adalah fimbrilin, yang dikode oleh gen fimA.
Protein adhesin yang terdapat di ujung fimbriae dan bertanggung jawab atas adhesi disebut FimH, yang dikode oleh genfimH (Zharaswati et al,2.
Keberadaan gen fimH tidak boleh langsung diartikan sebagai indikasi infeksi saluran kemih tanpa mempertimbangkan lokasi sampel dan gejala klinis.
Tidak semua strain E.
Coli yang memiliki gen menyebabkan penyakit.
Beberapa strain mungkin tidak memiliki kemampuan untuk menyebabkan ISK meskipun mereka memiliki gen fimH.
Dengan menggunakan primer yang spesifik untuk coli.
PCR dapat memastikan bahwa hanya DNA E.
coli yang diamplifikasi, sehingga mengurangi kemungkinan hasil positif palsu.
Dalam kondisi normal, urin seharusnya steril dan tidak mengandung Deteksi DNA E.
dalam urin normal menunjukkan adanya kontaminasi atau keberadaan flora normal.
Gen fimH terdapat pada bakteri Escherichia coli baik patogen maupun non Namun adanya gen fimH dan lingkungan yang memadai akan membuat Escherichia coli tumbuh lebih cepat dan mencapai batas quorum sensing yang menyebabkan teraktivasinya factor virulen (Kohar & Krisandi, 2.
Escherichia coli dapat diidentifikasi dengan cepat menggunakan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).
Teknik PCR memiliki keunggulan sensitivitas, kecepatan, dan menggunakan target gen spesifik pada bakteri tersebut.
Metode PCR yang digunakan dalam penelitian ini sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi keberadaan gen fimH E.
Keunggulan PCR terletak pada kemampuannya untuk mendeteksi sejumlah kecil bakteri DNA, yang mungkin tidak terdeteksi oleh Page | 202 Journal of Nursing and Health (JNH) Volume 10 Nomor 1 Maret Tahun 2025 Halaman :198 - 204 metode kultur konvensional.
SIMPULAN
Dari pemeriksaan yang telah dilakukan mengenai isolasi, uji kualitatif, uji kuantitatif dan amplifikasi PCR dapat disimpulkan bahwa terdapat gen fimH E.
Coli
terdeteksi pada 9 sampel urin dengan panjang target 164 bp, dan negatif pada 1
SARAN
Penelitian ini perlu dilanjutkan dengan memperbanyak jumlah sampel agar diperoleh informasi yang lebih mendalam terkait keberadaan gen firmH coli pada sampel urin responden normal maupun responden dengan gejala ISK.
UCAPAN TERIMA KASIH