Artikel Asli Peran Heat Shock Protein 47 sebagai Faktor Prediktor Prognosis Experimental Autoimmune Neuritis Studi eksperimental untuk mempelajari perjalanan penyakit Sindrom Guillain Barre menggunakan mencit Mus musculus Balb/C Ruslan Muhyi Bagian Anak RSUD Ulin Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Latar belakang.
Sindrom Guillain Barre (SGB) adalah salah satu kelainan immune-mediated peripheral neuropathy karena gangguan sistem imun dengan ciri paralisis akut.
Penelitian peran Hsp47 pada jaringan saraf pasien SGB tidak mungkin dilakukan pada manusia sehingga perlu model, experimental autoimmune neuritis (EAN) adalah animal model yang mirip SGB pada manusia.
Ekspresi Hsp47 merupakan biomarker prospektif untuk deteksi prognosis SGB sehingga kelumpuhan dapat dicegah tetapi imunopatogesis peran Hsp47 pada perubahan perjalanan penyakit SGB belum jelas.
Tujuan.
Membuktikan peran Hsp47 sebagai faktor prediktor prognosis perjalanan penyakit SGB.
Metode.
Penelitian eksperimental, sampel 30 mencit mus musculus Balb/C terdiri kelompok satu 10 sampel dengan pemberian myelin protein dosis 75 g, kelompok dua 10 sampel pemberian myelin protein 25 g, dan kelompok tiga 10 sampel diberi CFA .
omplete freud ajuvan.
sebagai kontrol.
Kemudian dibandingkan kadar HSP47 setiap kelompok berdasarkan derajat kelumpuhan yang dianalisis dengan uji Manova.
Hasil.
Kelompok satu terjadi 4 mencit lumpuh berat, 6 lumpuh ringan, sedang kelompok dua dan tiga tidak tidak terjadi kelumpuhan.
Pada mencit yang lumpuh berat terjadi peningkatan ekspresi Hsp47.
Il-2.
INF-G dan TNF-A.
Pada lumpuh ringan terjadi peningkatan ekspresi Il-5 dan Il-10.
Uji statistik menyatakan bahwa terdapat perbedaan bermakna kadar HSP47 antara kelompok perlakuan dengan kontrol.
Kesimpulan.
Ekspresi Hsp47 meningkat pada lumpuh berat, sehingga HSP47 dapat digunakan sebagai faktor prediktor prognosis SGB (Sari Pediatri 2009.
:296-.
Kata kunci: experimental autoimmune neuritis (EAN).
Sindrom Guillain Barre (SGB).
Hsp47 Alamat Korespondensi:
DR.
Dr.
Ruslan Muhyi.
SpA(K).
Devisi Neurologi Departemen Ilmu Kesehatan Anak FK Unlam RSUD Ulin Jl A.
Yani 43 Tilp/Fax 3269177 Banjarmasin Kalimantan Selatan indrom Guillain Barre (SGB) adalah penyakit yang sering menyebabkan gejala sisa berupa Angka kejadian SGB tidak terlalu banyak dilaporkan di masyarakat namun, namun kelumpuhan permanen akan membawa dampak sosial yang berat di kemudian hari.
Di samping gejala sisa, paralisis akut sistem pernafasan merupakan Sari Pediatri.
Vol.
No.
Februari 2009 Ruslan Muhyi: Heat shock protein 47 sebagai faktor prediktor EAN penyebab kematian pada SGB, sehingga penyakit ini dimasukkan dalam kategori neuroemergency.
Sebagai penyakit autoimun.
SGB yang menyerang saraf perifer.
Pada penyakit autoimun seperti SGB, akan terjadi peningkatan ekspresi heat shock protein (Hs.
terutama Hsp47 yang bersifat imunogen dan bisa berubah menjadi otoantigen.
Anti Hsp47 hanya ditemukan pada serum pasien penyakit autoimun dan tidak pada pasien non-autoimun.
3 Secara dugaan bahwa Hsp47 merupakan biomarker prosfektif untuk deteksi prognosis SGB.
Sejauh ini imunopatogesis SGB yang melibatkan Hsp47 dengan berbagai sitokin yang dihasilkan belum jelas.
Bila imunopatogenesis SGB yang melibatkan Hsp47 tidak diketahui dengan jelas, maka upaya penanggulangan komplikasi akibat SGB tidak optimal.
Gangguan otonomik merupakan komplikasi utama pada 25% pasien SGB berat.
Gangguan respirasi yang fatal sebagai akibat tidak cepat diobati secara tepat masih terjadi pada 33% pasien, sedang lumpuh persisten dapat ditemukan pada 7%-8%.
Evaluasi menemukan bahwa 85% akan mengalami perbaikan 6-18 bulan pasca awitan.
Penelitian terakhir menunjukkan bahwa insiden SGB 1,5-3/100 000, mortalitas sebesar 5% dan 10% mengalami gejala sisa neurologis berupa lumpuh pada setahun setelah awitan.
2,4,5
Ekspresi Hsp47 yang terdapat di dendrit dan akson sel saraf bila dilepas akan berperan pada otoreaksi sel T (CD.
Adanya induksi Hsp47 menyebabkan sel Th0 (T cell helpe.
berdiferensiasi menjadi sel Th1 dan sel Th2 yang memproduksi sitokin, sitokin pro-inCamasi baik yang dihasilkan oleh Th maupun makrofag menyebabkan semakin memperberat kerusakan mielin.
6-10 Selama ini imunopatogenesis SGB dipelajari melalui experimental autoimmune neuritis (EAN) yang merupakan model pada mencit dari SGB yang mencerminkan SGB pada manusia.
2,11-13
Terjadinya EAN dapat diinduksi dengan myelin protein melalui subkutan.
myelin protein merupakan salah satu penyusun mielin utama pada sel saraf, bila ada Myelin protein masuk ke dalam tubuh .
xternal agen.
, maka myelin protein akan berfungsi sebagai stressor yang menyebabkan peningkatan ekspresi heat shock protein pada sel saraf.
14,15 Pada pasien SGB, nampaknya akan terjadi peningkatan Hsp khususnya Hsp47.
Sehubungan dengan prosedur tata laksana dan pemeriksaan akhir yang fatal, maka eksperimen ini tidak memungkinkan menggunakan subjek manusia sehingga digunakan subjek mencit sebagai model EAN.
Sari Pediatri.
Vol.
No.
Februari 2009 Inokulasi myelin protein pada mencit maka, dalam tubuh mencit akan terjadi berbagai respons antara lain myelin protein dapat memicu pembentukan antibodi, sehingga antibodi tersebut akan mengikat mielin pada sel saraf, sehingga mielin mengalami kerusakan.
Selain itu antibodi dapat menempel di permukaan makrofag melalui Fc reseptor, selanjutnya antibodi di permukaan makrofag akan mengikat mielin pada sel saraf, adanya ikatan tersebut makrofag akan melepas MMP .
atrix metallo protei.
yang mengakibatkan kerusakan mielin melalui mekanisme ADCC .
ntibody dependent cellular Di sisi lain myelin protein tersebut akan berikatan dengan reseptor TLR .
oll-like recepto.
, di permukaan makrofag .
el dendriti.
, terutama TLR2, melalui signal tranduksi intraseluler, sel dendritik akan melepas Hsp47.
Hsp47 tersebut kemudian berikatan dengan TLR4 di permukaan sel dendrit.
Ikatan ini akan memicu signal tranduksi melalui inaktifasi IkB kinase, sehingga NFkB menjadi aktif dan selanjutnya akan memicu faktor trankripsi di inti dan dilepaskan berbagai sitokin antara lain IL-2.
IL-5.
IL-10.
IFN-G, dan TNF-D.
15 Interleukin tersebut bersifat sebagai neutroAle chemotactic factor, sehingga neutroAl akan tertarik pada daerah lesi dan melepas MMP.
2,16,17
Metode Besar sampel dihitung menggunakan rumus replikasi.
Replikasi adalah banyaknya perlakuan dalam percobaan.
Replikasi mempengaruhi jumlah ulangan .
, .
adalah jumlah kelompok perlakuan.
Jumlah ulangan tergantung pada derajat ketelitian yang diinginkan dan kualitas pengendalian keragaman yang mempengaruhi percobaan .
ahan, alat, media, dan lingkunga.
Kualitas pengendalian keragaman dijamin dengan memberikan kondisi yang homogen untuk lingkungan, media dan alat yang berkaitan dengan pemberian perlakuan serta mendiskripsikan secara jelas bahanbahan perlakuan yang digunakan.
Rumus besar sampel sebagai berikut, .
>15.
Dari rumus tersebut didapatkan sampel 30 mencit Mus musculus Balb/C yang dibagi menjadi kelompok 1 terdiri dari 10 sampel adalah kelompok dengan perlakuan pemberian myelin protein dosis besar 75g, kelompok 2 terdiri dari 10 sampel adalah kelompok perlakuan pemberian myelin protein dosis kecil 25g, dan kelompok kontrol terdiri dari 10 sampel 3 yang diberi CFA .
omplete freud ajuvan.
dosis 75g.
Semua subjek perlakuan yang Ruslan Muhyi: Heat shock protein 47 sebagai faktor prediktor EAN mengalami lumpuh dan juga subjek kontrol diambil darah vena perifer melalui ekor kemudian dilakukan pemeriksaan ELISA untuk mengetahui ekspresi Hsp47, sitokin pro-inCamasi dan anti-inCamasi pada darah, dilanjutkan pengambilan jaringan N.
pada sampel perlakuan dan kontrol untuk pemeriksaan imunohistokimia mengetahui ekspresi Hsp47 pada jaringan saraf.
Derajat paralisis skor 1 jika ekor lumpuh, skor 2 jika kedua kaki belakang lumpuh, skor 3 jika keempat kaki lumpuh tapi masih bisa berjalan, skor 4 jika keempat kaki lumpuh dan sama sekali tidak bisa berjalan dan skor 5 mencit mati.
Skor yang timbul pada mencit Balb/C jika skor 1, 2 dianggap lumpuh ringan dan skor 3, 4 dianggap lumpuh berat.
Kemudian dibandingkan kadar HSP47 dan sitokin inCamasi, anti-inCamasi setiap kelompok berdasarkan derajat Hasil dianalisis dengan uji Manova.
Hasil Pada tiga kelompok spesies Mus muscuklus Balb/C yang diberi perlakuan berupa injeksi subkutan myelin protein dosis 75 g, dosis 25 g dan dosis nol .
anpa myelin protein, hanya CFA) sebagai kontrol, variabel yang diamati adalah IL-2.
IFN-G.
TNF-A.
IL-5.
IL10.
Hsp47, anti Hsp47, dan luas ekspresi Hsp47 yang dihitung dengan metode imunohistokimia (IHK).
Reaksi paralisis pada kelompok perlakuan dengan pemberian myelin protein dosis besar 75 g setelah sensitisasi terjadi .
%) lumpuh berat dan .
%) lumpuh ringan.
Kelompok perlakuan dengan myelin protein dosis kecil 25 g setelah sensitisasi tidak terjadi lumpuh.
Kelompok perlakuan kontrol dengan CFA juga tidak terjadi lumpuh.
Rerata dan simpang baku setiap variabel pada ketiga kelompok perlakuan tertera pada Tabel 1.
Dari hasil analisis disimpulkan bahwa pemberian myelin protein dosis 75 g, dosis 25 g dan kontrol menghasilkan kadar IL-2.
IFN-G.
TNF-A.
IL-5.
IL-10.
Hsp47, anti Hsp47, dan luas ekspresi Hsp47 (IHK) yang berbeda bermakna, terutama antara pemberian myelin protein dosis 75 g dengan kontrol.
Untuk membuktikan pengaruh perubahan ekspresi Hsp47 kadar tinggi, sedang, dan rendah terhadap semua variabel dan klinis terjadi lumpuh Tabel 1.
Rerata dan simpang baku setiap variabel pada pemberian myelin protein dosis berbeda Variabel
IL-2
IFN-J
TNF-D
IL-5
IL-10
Hsp 47
Anti Hsp 47
Luas Ekpresi (IHK) Dosis 75
Rerata
204,71
98,00
185,52
31,77
209,43
0,77
0,14
0,87
63,99
31,21
59,84
2,70
35,19
0,10
0,01
0,02
Dosis 25
Rerata
137,07
56,22
135,34
39,27
657,41
0,55
0,12
0,82
11,15
4,71
6,68
2,92
161,69
0,03
0,00
0,01
Rerata
114,42
44,23
117,66
1088,56
0,45
0,11
0,80
9,97
6,94
13,08
14,89
288,71
0,05
0,00
0,01
Tabel 2.
Rerata dan simpang baku setiap variabel pada kadar Hsp47 yang berbeda Variabel
IL-2
IFN-G
TNF-A
IL-5
IL-10
Anti Hsp 47
Luas Ekpresi (IHK) Hsp47 kadar rendah
Rerata
117,62
9,98
46,43
6,89
121,06
12,29
49,07
13,24
1017,83
268,08
0,12
0,00
0,80
0,01
Hsp47 kadar sedang Rerata
149,47
8,20
64,15
7,23
142,50
6,06
36,02
2,51
415,25
157,38
0,13
0,00
0,84
0,01
Hsp47 kadar tinggi Rerata
236,79
65,35
115,50
28,79
210,89
67,19
30,37
2,60
191,97
7,48
0,15
0,01
0,88
0,01
Sari Pediatri.
Vol.
No.
Februari 2009 Ruslan Muhyi: Heat shock protein 47 sebagai faktor prediktor EAN Gambar 1.
Rerata setiap variabel pada ketiga kelompok kadar Hsp47 Gambar 2.
Pola Kontribusi setiap variabel pada ketiga kelompok kadar Hsp47 Tabel 3.
Pola kontribusi setiap variabel pada perbedaan kadar Hsp47 yang berbeda Variabel
Hsp47 kadar rendah
Hsp47 kadar sedang Hsp47 kadar tinggi Rerata
Rerata
Rerata
P_IFN-J
-259,68
38,57
-363,50
40,97
-663,10
165,33
P_IL-5
255,42
68,92
188,50
13,13
169,20
14,52
P_IL-10
297,20
78,28
116,68
44,22
57,39
2,23
P_asliHSP 3713,54 147,49 4134,51 143,62 5057,79 212,84 pada hewan coba digunakan analisis multivariat.
Perhitungan analisis tampak dari hasil rerata dan simpang baku pada Tabel 2 dan Gambar 1.
Hasil perhitungan dan uji multivariat dengan mengunakan metode WilksAo Lambda (F hitung= 0,.
dengan tingkat kemaknaan p<0,05 berarti secara statistik ada perbedaan yang bermakna dengan kata lain bahwa perbedaan kadar Hsp47 dapat mempengaruhi kondisi semua variabel penelitian IL2.
IFN-G.
TNF-A.
IL-5.
IL-10, anti Hsp47, dan luas ekspresi (IHK).
Untuk mendapatkan variabel IL2.
IFN-G.
TNF-A.
IL-5.
IL-10, anti Hsp47, dan luas ekspresi(IHK) yang berpotensi berpengaruh kuat .
terhadap perubahan kadar Hsp47 dilakukan analisis Hasil analisis diskriminan tertera pada Tabel 3 dan Gambar 2.
Akibat perbedaan ekspresi kadar hsp47 pada tujuh variabel dianalisis, didapatkan 4 variabel yang dominan yaitu IFN-G.
IL-5.
IL-10, dan anti Hsp47.
Pembahasan Pada saat sel Schwann menerima stresor dari luar yaitu berupa myelin protein akan terjadi proses seleksi pada Sari Pediatri.
Vol.
No.
Februari 2009 sel T yaitu autoreactive pada sel T.
Proses autoreactive ini menyebabkan sel T berdiferensiasi menjadi VE sel T dan GS sel T.
Pemilihan diferensiasi sampai saat ini belum jelas mekanismenya tapi mempunyai implikasi yang sangat berbeda.
Saat terjadi diferensiasi ke arah SB sel T tersebut bersifat self sehingga dikenali oleh sistem imun dan akan dieliminasi .
i-apoptosi.
dari tubuh.
Sedangkan GS sel T bersifat non self artinya tubuh tidak mengenali dan ini sangat berbahaya, oleh karena akan terjadi reaksi merusak jaringan tubuh sendiri berupa reaksi autoimun.
18 Pada saat terjadi reaksi autoimun mielin yang dibentuk oleh sel Schwann akan mengalami autoreaksi sehingga terjadi demielinisasi.
Dalam keadaan stres, sel akan mengalami peningkatan ekspresi Hsp47 karena mielin mengalami kerusakan atau nekrosis.
Selanjutnya Hsp47 akan disekresikan secara pasif ke ekstraselular yang dapat bertindak sebagai autoantigen dan mengadakan autoreaksi dengan ganglioside saraf yang menyebabkan penyakit Ekspresi Hsp yang keluar dari sel tersebut akan berada di sirkulasi darah dan akan memberikan signal kepada sistem imun.
19 Mekanisme tersebut tidak akan terjadi pada sel yang mengalami apoptosis, karena dinding sel yang mengalami apoptosis tetap utuh sehingga Hsp tetap berada di dalam sel yang akan dipagosit oleh APC.
Penelitian ini membuktikan Ruslan Muhyi: Heat shock protein 47 sebagai faktor prediktor EAN saat inokulasi myelin protein terjadi stres pada mielin sehingga terjadi peningkatan ekpresi Hsp47.
Saat stres terjadi peningkatan ekspresi Hsp intraselular, semula bersifat protektif dan menginduksi sel anti-apoptosis.
Stres yang berlangsung lama menyebabkan produksi Hsp berlebihan dan bertindak sebagai ligan yaitu berikatan dengan protein leader yang ada di sitosol menembus dinding sel keluar dari dalam sel dan masuk secara pasif ke dalam sistem 19 Di dalam sirkulasi darah Hsp ekstraselular yang bebas mempengaruhi reseptor berupa seven helix transmembrane protein receptor yang melekat .
pada membran sel T, lalu mengikat reseptors tersebut.
Ikatan reseptors Hsp dengan reseptor pada membran sel T mempengaruhi proses enzimatik pada sel T tanpa Hsp harus menembus masuk ke dalam sel.
15 Ikatan reseptor-Hsp dengan reseptors membran sel T diduga menyebabkan diferensiasi sel T autoreaktif.
Peran TCR yang dimediasi oleh kompleks MHC-peptid pada epitel kelenjar timus adalah salah satu teori penyebab diferensiasi tersebut.
Interaksi TCR-MHC pada low avidity menyebabkan reaksi positif, sementara pada high avidity menyebabkan reaksi negatif atau terjadi penyakit autoimun.
Aviditas ditentukan oleh tiga parameter yaitu pertama aAnitas intrinsik antara TCR dan kompleks MHC-peptid kedua oleh densitas TCR pada membran permukaan sel T dan ketiga oleh densitas TCR-kompleks MHC-peptid pada membran APC.
18 Ketiga parameter tersebut bersama dengan molekul CD8.
CD4 dan MHC kelas I atau kelas II menyebabkan induksi unique peptide sehingga terjadi proses seleksi diferensiasi positif dan Namun eliminasi AB sel T oleh self reactive TCR masih belum jelas.
Tidak hanya GS sel T yang terlibat pada destruksi jaringan, mekanisme lain juga berperan pada penyakit autoimun seperti sel NK.
APC, dan antibodi spesiAk sel B menyebabkan plaque pada penyakit autoimun multipel sklerosis .
enyakit SSP mirip SGB), plaque tersebut berkolonisasi pada oligodendroglial mengekspresikan Hsp, aksi GD sel T disini bersifat sebagai sitotoksik.
15,20 Dalam keadaan normal, potensial reaktivitas sel T perifer mengontrol mekanisme toleransi di daerah perifer.
Pada model percobaan penurunan ekspresi TCR menyebabkan toleransi pada sel T perifer terhadap self antigen, sedangkan penurunan regulasi TCR dan kostimulator CD28 menyebabkan aktivasi sel T.
Hal ini oleh karena CD28 akan berinterkasi dengan B7-1 (CD.
dan B7-2 (CD.
pada APC.
Level ekspresi B7 inilah yang menyebabkan aktivasi sel T tidak hanya di perifer tapi juga di timus.
Sekali sel T menjadi aktif, maka akan terjadi ekspresi CTLA-4 (CD.
karena reseptornya mirip CD28.
Ikatan CTLA-4 dengan B7 pada APC memperlihatkan aviditas lebih besar daripada CD28, sehingga memberikan signal inhibisi pada sel T.
Dampak inhibisi CTLA-4 pada sel T menyebabkan induksi sistem imun untuk memproduksi sitokin pro-inCamasi seperti Il-2.
Ekspresi Hsp ekstraselular juga akan dilepas ke exosome, internal vecicles multi vecicular bodies (MVB) yang dilepas ke ekstraselular, kemudian akan mengikat reseptor pada sel membran.
19 Ikatan Hsp-exosome-receptors pada sel membran merupakan mediator imunostimulator MHC kelas I dan kelas II yang berimplikasi pada sistem imun.
Pada saat yang bersamaan akibat peningkatan ekspresi Hsp sel saraf akan mengalami demielinisasi yang merupakan tanda sel mengalami nekrosis.
Jadi produksi Hsp yang meningkat, menyebabkan demielinisasi yang akan menyebabkan Hsp intraselular secara pasif keluar ke dalam sistem sirkulasi.
Di dalam sirkulasi Hsp akan memberikan signal pada sistem imun dan menstimulus sintesis sitokin pro-inCamasi.
19 Penelitian ini membuktikan hal tersebut berupa peningkatan ekspresi Il-2.
Inf-G dan TNF-A sehingga memperberat EAN.
Ekspresi Hsp47 yang terdapat pada dendrit dan akson sel saraf bila dilepas akan berperan pada autoreaksi sel T (CD.
Adanya induksi Hsp47 menyebabkan sel Th0 (Tcell helpe.
berdiferensiasi menjadi sel Th1 dan sel Th2 yang memproduksi sitokin, sitokin pro-inCamasi baik yang dihasilkan oleh Th maupun makrofag menyebabkan semakin memperberat kerusakan mielin.
6,7,8,9,10
Inokulasi myelin protein pada mencit pada penelitian kami menyebabkan peningkatan ekspresi Hsp47.
Jika pengaruh Hsp47 pada sel T helper lebih ke arah sitokin inCamasi akan terjadi EAN berat apabila pengaruh pada sitokin anti-inCamasi maka, kerusakan mielin lebih ringan yang menyebabkan EAN ringan.
Dari uraian tersebut disimpulkan bahwa Hsp47 dapat digunakan sebagai deteksi faktor prognosis perjalanan EAN yang merupakan model dari SGB.
Demikian juga permasalahan mengenai progresivitas EAN, ternyata Hsp47 bekerja melalui ekspresi sitokin pro-inCamasi dan anti-inCamasi.
Sari Pediatri.
Vol.
No.
Februari 2009 Ruslan Muhyi: Heat shock protein 47 sebagai faktor prediktor EAN
Daftar Pustaka