Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Kajian Bioinformatika Uncoupling Protein 2 (UCP.
dan Mutasi Ala55Val UCP2 Pada Obesitas dan Diabetes Melitus Tipe 2 (DMT.
Susmiarsih1,2* .
Hidayat Trimarsanto3 Program Doktor Ilmu Biomedik.
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Jakarta Departement Biologi.
Fakultas Kedokteran Universitas YARSI.
Jakarta Lembaga Biologi Molekul Eijkman.
Jakarta Korespondensi : email : tri.
panjiasih@yarsi.
Abstrak Pendahuluan.
Kemajuan pengetahuan suatu penyakit sangat didukung oleh kajian tingkat molekuler sampai klinis.
Bioinformatika menjembati perkembangan pengetahuan analisis seluler dan molekular dengan klinis.
Selain dipengaruhi faktor lingkungan, faktor genetik diketahui berperan dalam patomekanisme penyakit obesitas dan DMT2.
UCP2 berpengaruh terhadap BMI .
asal mass inde.
pada penderita obesitas dan berpengaruh terhadap sekresi insulin pada penderita diabetes melitus tipe 2.
Kajian ini bertujuan mengetahui informasi genetik gen dan protein UCP2 serta peran mutasi Ala55Val pada obesitas dan diabetes melitus tipe 2.
Metode.
Kajian bioinformatika gen dan mutasi UCP2 menggunakan data base situs http://w.
http://w.
org dan http://w.
Profil, struktur dan fungsi protein UCP2 dikaji dengan situs http://w.
org, http://w.
dtu/dk, http://w.
http://bioinf.
uk/psipred/ dan http://w.
Disain primer dan titik mutasi Ala55Val UCP2 dikaji dengan situs Primer3 dan REBASE.
Hasil dan kesimpulan.
Gen UCP2 Homo sapiens (NC_000011.
terdiri atas 8 ekson dan 7 intron dengan panjang basa nukleotida 8174 bp.
Protein UCP2 (NP_003.
mempunyai 309 asam amino, merupakan protein integral yang berlokasi di membran mitokondria bagian dalam.
Struktur protein terdiri atas heliks dan koil.
Fungsi UCP2 sebagai protein transporter, uncoupling proton pada fosforilasi oksidatif, termogenesis dan keseimbangan energi dengan cara mengubah gradien proton.
Mutasi Ala55Val dapat dianalisis dengan mengamplifikasi target sekuen yang diinginkan dengan cara mendesain primer dan titik mutasi dideteksi dengan enzim retriksi yang mengenali titik Ala55Val merupakan mutasi missense yang terjadi di posisi mRNA ke 164, mengubah GCC menjadi GTC, mengubah translasi protein nomer 55 alanin menjadi valin.
Titik mutasi ini berdekatan dengan situs fosforilasi Protein C Kinase (PCK) protein, situs yang berperan mengatur jumlah ATP dalam proses termogenesis dan sekresi insulin.
Informasi genetik gen, protein UCP2 serta peranannya dalam obesitas dan diabetes melitus tipe 2 dapat diperoleh dengan menggunakan database bioinformatika.
Kata kunci : Uncoupling protein.
Primer desain and Missense mutation Pendahuluan Kemajuan pengetahuan suatu penyakit sangat didukung oleh kajian tingkat dasar molekuler sampai tingkat klinis.
Bioinformatika analisis seluler dan molekular dasar dengan Pada tingkat klinik, perawatan pada preventif dan terapi, yang didasari oleh penemuan biologik dari berbagai penelitian.
Bioinformatika penyimpanan dan analisis data biologik dasar, termasuk sekuen DNA, ekspresi RNA, protein dan molekul kecil yang berada di dalam dan (Altman.
Penelitian mengaplikasikan metode yang data genetik dan seluler dengan konsep-konsep klinik seperti metode pengobatan, penyakit dan gejala-gejala yang diderita pasien (Altman dan Miller, 2.
Obesitas merupakan suatu masalah kesehatan bagi sebagian besar negara di dunia, dengan prevalensi yang cenderung meningkat setiap tahun dan dapat memicu timbulnya sindroma metabolik lainnya, seperti diabetes mellitus tipe 2 (DMT.
Obesitas Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
adalah suatu gangguan atau gejala yang ditandai penimbunan lemak yang berlebih di bawah kulit.
Sementara itu Diabetes mellitus (DM) didefinisikan sebagai suatu penyakit metabolik yang mempunyai ciri ditemukannya kadar glukosa darah yang tinggi .
akibat adanya gangguan dalam sekresi insulin atau kerja insulin di jaringan target.
Selain dipengaruhi faktor lingkungan, faktor genetik diketahui turut berperan dalam patomekanisme penyakit obesitas dan DMT2.
Banyak studi yang mengkaitkan kedua penyakit tersebut dengan genetik melalui mekanisme keseimbangan energi, terutama termogenesis dan homeostatis glukosa (Rousset et al.
, 2.
Pengaturan keseimbangan energi dan metabolisme dalam termogenesis terjadi di mitokondria, organel sel ini menginduksi perpindahan proton dalam menghasilkan ATP melalui proses fosforilasi oksidatif .
xidative phosphorylase.
OXPHOS) dan berperan menurunkan radikal bebas .
eactive oxygen species.
ROS) (Bouillaud.
Salah satu komponen mitokondria yang penting untuk mengatur jumlah ATP intraseluler uncoupling protein 2 (UCP.
Pengaturan jumlah ATP ini berperan terhadap proses termogenesis dan sekresi insulin oleh sel beta pankreas.
Kedua proses tersebut menjadi dasar pemikiran biologi molekular dalam mempelajari patomekanisme obesitas dan Banyak penelitian yang telah dilakukan untuk mempelajari peran gen ini dalam obesitas dan diabetes mellitus.
Wang et .
Boulotta et al.
dan Lapice et .
membuktikan bahwa varian UCP2 berpengaruh terhadap BMI .
asal mass inde.
pada penderita obesitas dan berpengaruh terhadap CRP .
-reactive protei.
, sekresi insulin pada penderita diabetes melitus tipe 2.
UCP2 merupakan molekul target untuk mempelajari etiologi dan perlakuan obesitas (Heidari et al.
Polimorfisme gen UCP2 dapat susceptibel terhadap diabetes melitus pada etnis tertentu (Xu et al.
Penelitian peran mutasi SNP .
ingle nucleotide polymorphism.
Ala55Val gen UCP2 pada obesitas dan diabetes melitus sangat membutuhkan penelusuran bioinformasi, baik pengetahuan tentang gen, protein maupun penelusuran informasi penting lainnya yang Artikel Penelitian mendukung suatu penelitian.
Diharapkan dengan penelusuran bioinformasi ini, penelitian menjadi lebih terarah dan mudah dilaksanakan.
Makalah ini bertujuan untuk menelusuri dan dan mengkaji bioinformasi genetik UCP2 dan peran mutasi Ala55Val pada obesitas dan diabetes melitus tipe 2.
Material dan Metoda Material Gen UCP2 yang diperoleh dari situs http://w.
number NC_000011.
9, mRNA UCP2 dengan NM_03355.
2 dan protein UCP2 dengan NP_003346.
Metoda
Analisis struktur, transkrip dari gen
UCP2
menggunakan database bioinformatika dari situs http://w.
gov menu PubMed, http://w.
http://w.
Analisis mutasi Ala55Val UCP2 dapat http://w.
http://w.
gov menu OMIM dan SNP.
Analisis komposisi, profil dan lokasi dari protein UCP2 dan mutan Ala55Val
UCP2
http://w.
http://w.
dtu/dk TargetP.
SignalP.
TMHMM, http://w.
org dan http://bioinf.
uk/psipred/ menu
MEMSAT3 & MEMSAT-SVM
Analisis struktur sekunder melalui situs http://bioinf.
PSIPRED dan 3D protein UCP2 serta analisis komparatif dengan Ala55Val
UCP2
http://w.
org menu Swiss Model dan software PYMOL Desain primer yang digunakan untuk menggunakan situs Primer3, situs PerlPrimer dan menentukan titik retriksi untuk mengidentifikasi mutasi dengan situs REBASE.
Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Hasil Penelusuran Dan Diskusi Analisis UCP2 : Struktur Gen.
Transkrip mRNA dan Protein Kajian terhadap struktur gen UCP2 Homo sapiens dapat dicari melalui situs http://w.
gov menu gene.
Accession number gen UCP2 yang diambil adalah sekuen referensi .
eference sequence, refse.
untuk genom NC_000011.
9, sekuen memiliki struktur dengan panjang basa nukleotida 8174 bp, berbentuk DNA linear, tersusun mulai dari daerah komplemen .
lokasi pada kromosom 11q13 dari Homo Lokasi gen UCP2 ditunjukkan pada Gambar 1.
Gen UCP2 Homo sapiens ini terdiri atas 8 ekson dan 7 intron dimana ekson 1 dan 2 tidak ditranslasikan.
Panjang basa nukleotida gen UCP2 sekitar 8.
7 kb .
dan lokasinya terletak 7-8.
2 kb arah hilir dari gen
UCP3
(Argyropoulous et Pecqueur et al.
, 1999.
Ricquier dan Bouillaud.
Hasil pencarian mRNA UCP2 melalui situs http://w.
gov menu gene NM_03355.
mempunyai panjang sekuen 1646 bp, berbentuk Hasil transkrip menunjukan gen UCP2 mempunyai 8 ekson .
kson 1 posisi basa 124, ekson 2 posisi pada basa 125.
ekson 3 posisi pada basa 282.
506, ekson 4 posisi pada basa 507.
717, ekson 5 posisi pada 912, ekson 6 posisi pada basa 1014, ekson 7 posisi pada basa 1195 dan ekson 8 posisi pada basa Menurut Riquier dan Bouillaud .
transkrip mRNA dimulai dari ekson i, ekson I dan II tidak .
Sedangkan Pecqueur et.
mengatakan daerah promoter gen UCP2 tidak mempunyai boks TATA atau boks CAAT namun daerah ini banyak mengandung basa G dan C (Gambar .
Protein UCP2 yang diambil melalui situs http://w.
gov menu protein dengan accession number NP_003346 .
umber refseq NM_003.
mempunyai 309 asam amino Melalui http://w.
menu BLASTAi protein BLAST, dapat ditelusuri kemiripan .
sekuen protein UCP2 Homo sapiens ini dengan spesies lain .
atau dengan sekuen protein lain .
dalam Homo sapiens itu sendiri.
Didasarkan pada nilai identifikasi .
uery coverag.
100%, nilai E O 0, sumber sekuen referensi .
yang serupa (NP) dan paling dekat nilainya maka accession number yang diambil untuk orthologi adalah NP_0011268.
1 (UCP2 Pongo abeli.
dan untuk paralogi adalah NP_003347.
1 (UCP3
Homo sapien.
(Gambar .
Perbandingan fungsi dan atribut protein UCP2 Homo sapiens, orthologinya UCP2 Pongo abelii dan paraloginya UCP3 Homo sapiens http://w.
menu UniProtKB.
Gambar 1.
Lokasi gen UCP 2 pada kromosom 11.
Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
UCP2
PolyA site UCP3
Ekson
ATGS
ATG
i IV Artikel Penelitian TGA V VI VII Vi Gambar 2.
Daerah Ekson UCP2.
UCP2 terdiri dari 8 ekson, transkripsi dimulai dari ekson i, situs inisiasi transkripsi (ATG) terletak 7-8,2 kb hilir dari situs poliadenilasi UCP3.
Gambar 3.
Homologi protein UCP2 Homo sapiens.
Orthologi UCP2 Homo sapiens adalah protein UCP2 Pongo abelii dengan kemiripan sekuennya 99%.
Paralogi UCP2 Homo sapiens adalah protein UCP3 Homo sapiens dengan kemiripan sekuennya 72%.
Hasil penelusuran menunjukan bahwa protein UCP2 Homo sapiens .
kses nomer P55.
, protein UCP2 Pongo abelii .
kses nomer Q5R5A.
dan protein UCP3 Homo sapiens .
kses nomer P55.
, memiliki fungsi yang sama yaitu sebagai protein transporter, termogenesis dan keseimbangan energi serta ketiga protein tersebut berada pada membran mitokondria bagian dalam.
Ekspresi dan Fungsi Klinis UCP2 pada Obesitas dan DMT2 Kajian bioinformatika fungsi dari UCP2 dapat http:// http://w.
gov menu PubMed.
UCP
merupakan anggota dari protein transporter mitokondria yang memperantarai perpindahan Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
secara uncoupling yang melintasi membran mitokondria bagian dan proton tesrsebut dihasilkan oleh transpor elektron dalam proses respirasi dan sintesis ATP dari ADP (Dalgaard dan Pedersen, 2001.
Pankow et Proses uncoupling ini lebih banyak menghasilkan panas dibanding energi (Wang et 2.
, sehingga UCP2 sangat terkait dengan termogenesis dalam tubuh.
Hingga tahun 1997 sudah dikenal 3 gen homolog dari UCP yaitu UCP1.
UCP2 dan UCP3.
UCP2 ini memiliki asam amino yang identik 59% dengan UCP1, jumlah asam aminonya 309 dan berat molekul 33,2 kDa, sedangkan UCP3 memiliki homologi sekitar 73% dengan UCP2 (Riquier dan Bouillaud, 2.
UCP2 diekspresikan dalam ginjal, paru-paru, sel makrofag, sel T dan secara luas diekspresikan di jaringan adiposa putih, otot skeletal, sel pankreas dan sistem saraf pusat ( Fleury et al.
1997 dan Saleh et al.
Untuk mendapatkan informasi tentang fungsi dan peran klinis protein UCP dapat membuka situs http://w.
gov menu
OMIM,
PubMed http://w.
menu UniProtKB.
Protein UCP berperan pada termogenesis, pengaturan sintesis ATP, mengontrol produksi ROS dan menghambat sekresi insulin.
Protein UCP berperan pada manifestasi klinis berupa obesitas dan diabetes melitus.
Fungsi UCP dengan cara mengubah gradien proton untuk molekular pengeluaran energi yang penting untuk mempelajari obesitas dan DMT2 (Gambar Kaitan protein UCP2 dengan obesitas dan DMT2 dapat diihat pada Gambar 5.
Gambar 4.
Peran UCP dalam rantai respirasi sel.
Gradien proton H , yang dihasilkan oleh komplek senzim respirasi, digunakan oleh ATP sintetase untuk fosforilasi ADP menghasilkan ATP.
Mekanisme lain untuk penggunaan gradien proton adalah UCP yang menguncoupling H , yang akan menurunkan sintesis ATP (Rousset et al.
Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Artikel Penelitian Gambar 5.
Peran utama UCP2 pada obesitas dan DMT2.
Peningkatan ekspresi UCP2 menurunkan risiko obesitas pada jaringan lemak dan otot skelet, namun pada sel pankreas, retina dan sel ginjal dapat meningkatkan risiko DMT2 .
e Souza et al.
Varian genetik UCP2 : Ala55Val Untuk mengetahui variasi genetik alami dan perannya dari gen UCP2 dapat ditelusuri melalui situs http://w.
http://w.
menu SNP atau PubMed.
Hasil pencarian dengan kode P55851 menunjukan gen UCP2 mempunyai 5 macam variasi alami yaitu Ala55Val .
Arg76Gln .
Arg154Gln .
Ala268Gln .
dan Ser282Cys .
Hasil pencarian dengan menu Pubmed, ada variasi lain yang sudah diteliti yaitu mutasi pada daerah promotor G(-.
A .
dan Ins/Del di ekson 8.
Selain dengan situs di atas, eksplorasi bioinformasi varian UCP2 dapat juga di telusuri melalui situs http://w.
Mutasi Ala55Val merupakan mutasi missense yang terjadi di posisi CDS mRNA ke 164, mengubah kodon GCC menjadi GTC, perubahan ini menyebabkan perubahan translasi protein nomer 55 alanin menjadi valin.
UCP2
merupakan faktor risiko terhadap DMT2 pada individu Asia tetapi tidak berpengaruh terhadap individu Eropa (Xu et al.
, di populasi Indian Asia polimorfisme ini menurunkan risiko DMT2 (Vimaleswaran et al.
Mutasi Ala55Val UCP2 .
dapat dijadikan marker risiko terjadinya obesitas pada wanita namun tidak pada pria di populasi Jepang (Kosuge et al.
, varian ini merupakan faktor predisposisi obesitas dan meningkatnya sekresi insulin pada populasi aborigin di Taiwan (Wang et al.
Hasil studi yang berbedabeda pada berbagai populasi ini mungkin disebabkan variasi genetik Ala55Val gen UCP2 menghasilkan pengaruh yang berbeda pada beragam ras dalam hal pengeluaran energi (Kimm et al.
, 2.
Analisis protein UCP2 :
Komposisi, profil dan lokasi Untuk protein digunakan situs http://w.
menu ProtParam.
Hasil pencarian menunjukan komposisi protein UCP2 (Tabel .
Dari hasil ProtParam diketahui ada beberapa perbedaan komposisi mutan Ala55Val UCP2 dengan normal antara lain berat molekul 4, jumlah atom 4691, indeks alifatik 83.
dan GRAVY 0.
Hasil penyelusuran lebih lanjut ke situs http://w.
org/protscale , profil skala asam amino menunjukan bahwa berat molekul, nilai hidrofobik .
ydrophobic, hpho.
(Gambar .
, polaritas dan hplc dari masing-masing molekul yang menyusun protein normal dan mutan Ala55Val UCP2 mempunyai nilai yang sama.
Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Tabel 1.
Komposisi protein UCP2 Komposisi UCP2 Jumlah asam amino : 309 Berat molekul : 33229.
3 Dalton Nilai pI : 9.
Komposisi Atom :
Carbon Hydrogen H Nitrogen Oxygen Sulfur Komposisi UCP2 Formula: C1476H2353N413O427S16 Jumlah atom: 4685 Estimasi waktu paruh pada mamalia : 30 jam Indeks instabilitas : 41.
Indeks alifatik : 82.
Grand average of hydropathicity (GARVY) : 0.
Gambar 6.
Profil skala nilai hidrofobik .
protein normal dan Ala55Val UCP2.
Profil skala nilai hphop antara protein normal dan mutan adalah sama.
Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Lokasi protein UCP2 dapat diprediksi http://w.
dtu/dk TargetP.
TargetP lokalisasi protein subseluler eukariotik yang didasari pada sekuen N-terminal dari motif protein, program ini untuk membedakan protein mitokondria, kloroplas, protein sekretori dan protein lainnya (Emanuelsson et al.
Penulusuran topologi protein UCP2 melalui situs http://w.
dtu/dk TMHMM menunjukan protein ini bukanlah merupakan protein transmembran (Gambar .
Namun penelusuran http://w.
http://w.
PubMed menunjukan bahwa lokasi subseluler protein UCP2 Homo sapiens (P55.
berada di mitokondria bagian dalam dan merupakan protein integral.
Prediksi lokasi protein dilanjutkan dengan penelusuran melalui situs http://w.
org yang menyatakan UCP2 Homo teridentifikasi 100% berlokasi di membran mitokondria bagian dalam dan merupakan protein integral.
Artikel Penelitian WoLF
PSORT
yang sering digunakan untuk memprediksi lokasi protein subseluler.
WoLF PSORT mengkonversi sekuen asam amino menjadi gambaran lokalisasi numerik yang didasari pada sinyal, komposisi asam amino dan motif fungsional (Horton et al.
Topologi protein juga dapat ditelusuri melalui situs http://bioinf.
uk/psipred/ MEMSAT3 & MEMSAT-SVM yang menyatakan UCP2 merupakan protein transmembran dengan 6 domain (Gambar .
Kajian bioinformatik untuk menelusuri ada tidaknya N-terminal sinyal peptida dan letak situs pemotongan dari sinyal peptida untuk protein yang akan disekresi keluar sel .
rotein sekretor.
juga dapat dilakukan melalui situs SignalP.
Dari hasil penelusuran, protein UCP2 dan mutan Ala55Val UCP2 bukan merupakan protein sekretori .
on secretory protei.
dengan probabilitas signal peptide 0.
066, probabilitas signal anchor 0.
002 dan probabilitas letak situs 020 pada asam amino antara posisi 27 dan 28.
Gambar 7.
Prediksi topologi protein UCP2.
Protein UCP2 bukan merupakan protein transmembran .
itus w.
dtu/dk TMHMM).
Protein UCP2 merupakan protein transmembran dengan 6 domain Kedua ujung terminal N maupun C menghadap ruang intra membran.
Protein terdiri dari 6 heliks asam amino yang dihubungkan oleh loop .
itus http://bioinf.
uk/psipred/result/464098 ).
Analisis protein UCP2 : Struktur sekunder dan 3D Pengetahuan tentang struktur protein berperan penting untuk mengerti fungsi protein (Watson et al.
, rekonstruksi struktur protein (Dawyer et al.
dan studi interaksi protein dengan protein (Russell et al.
Prediksi struktur protein dengan menggunakan bioinformatik meliputi pencarian sekuen yang serupa, membandingkannya dengan berbagai sekuen, identifikasi dan karakterisasi domain.
Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
prediksi struktur sekunder, penanda protein, mengkonstruksi dan memvalidasi model tiga dimensi (Edwards dan Cottage, 2.
Struktur sekunder merupakan distribusi residu asam amino yang spesifik yang berada di sekeliling hingga ujung menyusun rantai -heliks atau -strand (Duan et al.
Untuk memprediksi struktur sekunder protein dapat dicari melalui situs http://bioinf.
menu PSIPRED.
Protein UCP2 dan Ala55Val UCP2 memiliki struktur sekunder yang tersusun heliks dan koil (Gambar .
Situs PSIPRED merupakan situs protein berdasarkan sekuen asam aminonya dengan akurasi tinggi (McGuffin et al.
ndan paling banyak digunakan.
Untuk mencari model struktur protein 3 dimensi .
D) http://w.
gov menu BLAST atau http://w.
org/pdb/ Hasil pencarian menunjukan model protein UCP2 mirip dengan 2LCK_A (GI:342350.
yang sudah dipublikasi oleh peneliti sebelumnya (Gambar .
Gambar 8.
Struktur sekunder protein UCP2.
Gambar 9.
Model 3D protein UCP2.
Model protein UCP2 mirip dengan molekul 2LCK_A dengan kemiripan sekuen 96% dan nilai E-value 0e 00.
Model 3D protein 2LCK_A.
Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Jika protein yang dicari belum mempunyai model struktur 3D maka dapat meminta bantuan http://w.
SwissModel dan klik automated mode, atau situs http:// http://w.
Pembuatan model struktur 3 dimensi harus dimulai dengan menyimpan data model dalam bentuk PDB file yang merupakan hasil pencarian dari situs http://w.
com atau hasil dari pencarian di situs http://w.
com menu SwissModel sub menu Automated mode yang dikirim server ke alamat email kita.
Kemudian dengan program PYMOL kita dapat merekonstruksi model struktur UCP2.
Mutasi missense SNP Ala55Val terletak di struktur 3D UCP2 asam amino urutan ke 55 yang mengubah Alanin (A) menjadi Valin (V) .
ata RefSNP/dbSNP rs660.
Dilihat dari Scoring Matrix perubahan A menjadi V mempunyai nilai 0, artinya kedua asam amino tersebut secara bermakna tidak similaritas (A = hidrofobik, non polar, alifatik.
V = hidrofobik, non polar, tin.
(Gambar .
Untuk melakukan analisa fungsi protein mutan, terlebih dahulu kita mencari situs aktif dari protein UCP2 melalui http://w.
com menu Prosite.
Protein UCP2 Homo sapiens mempunyai 4 situs aktif yaitu situs fosforilasi protein kinase C (PKC pada posisi basa 14-16, 36-38, 94-96, 102104, 303-.
, situs N-miristoilasi .
ada posisi Artikel Penelitian basa 19-24, 21-26, 61-66, 64-69, 81-86, 98-103, 110-115, 123-128, 174-179, 178-183, 223-228, 248-253, situs amidasi .
osisi 152-.
dan situs fosforilasi casein kinase II (CK2 pada posisi basa 233-236, 303-.
Setelah kita mempunyai data situs aktif protein dari Prosite, kemudian merekonstrusi protein mutan Ala55Val dan situs aktif protein dengan PYMOL (Gambar Dari hasil rekonstruksi posisi SNP Ala55Val dengan situs aktif, posisi single nucleotide polymorphisme (SNP) .
asa nukleotida ke 164.
GCC menjadi GTC) berdekatan dengan situs fosforilasi Protein C Kinase (PCK), posisi yang berdekatan ini mungkin dapat mengganggu fungsi fosforilasi PKC protein UCP2.
Salah satu komponen mitokondria yang penting untuk mengatur jumlah ATP intraseluler adalah protein 2 (UCP.
Pengaturan jumlah ATP ini berperan terhadap proses termogenesis dan sekresi insulin oleh sel beta pankreas.
Peningkatan ekspresi UCP2 dapat menurunkan risiko obesitas pada jaringan lemak dan otot skelet, namun pada sel pankreas dapat meningkatkan risiko DMT2 melalui hambatan sekresi insulin .
e Souza et al.
Kedua proses tersebut menjadi dasar pemikiran biologi molekular dalam mempelajari patomekanisme obesitas dan diabetes.
Gambar 10.
Model struktur 3D protein UCP2.
Struktur 3D protein UCP2 tersusun atas bentuk heliks .
dan koil .
Struktur 3D Ala55Val UCP2 sama dengan protein normal UCP2 hanya ada satu mutasi asam amino no 55 yang mengubah alanin menjadi valin.
Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Gambar 11.
Struktur protein dan situs aktifasi Ala55Val UCP2.
Titik mutasi Ala55Val berada dekat dengan situs fosforilasi PCK.
Identifikasi Ala55Val UCP2 : Disain primer dan situs retriksi Desain primer merupakan tahap inisiasi yang penting untuk melakukan polymerase chain reaction (PCR) dengan target amplifikasi yang sesuai keinginan.
Banyak faktor yang dapat membatasi keberhasilan primer antara lain dimer, temperatur melting yang ekstrem, produk alternatif amplifikasi, variasi spesifik genotip (Li dan Brownley, 2.
Primer3 merupakan program komputer untuk mencari kandidat pasangan primer yang spesifik untuk mengamplifikasi sekuen nukleotida target.
Untuk mendesain primer, diawali dengan http://w.
http://w.
gov menu SNP.
Hasil penelusuran menunjukan protein UCP2 .
kses P55.
mempunyai variasi genetik alami antara lain mutasi titik asam amino no 55 yang mengubah A menjadi V, akses dbSNP rs660339 dari NCBI menginformasikan merujuk refseq gene NG_011478 mutasi Ala55Val UCP2 terjadi pada posisi basa nukleotida 9786, merujuk refseq mRNA NM_003355 mutasi berada pada posisi 544 yang mengubah basa C (Gambar .
dan refseq NP_003346.
2 titik mutasi pada asam amino no.
55 yang mengubah residu asam amino Alanin (Al.
menjadi Valin (Va.
Mendesain primer
dapat menggunakan Primer3
Plus
BLAST
http://w.
Untuk Primer3 Plus, data yang dipakai adalah data fasta dari refseg gene, sedangkan primer BLAST data yang dipakai dapat refseg genom atau mRNA.
Hasil Primer BLAST memberi beberapa pasang primer, pemilihan pasangan primer terbaik didasari atas panjang basa primer, suhu melting (TM), kandungan GC, terbentuknya palindroma .
imer dan false primin.
, sekuen 3Ao-end dan primer yang dapat degenerasi (Abd-Elsalam.
Disain primer untuk mutasi Ala55Val UCP2 dengan software Primer Blast didapatkan Forward Primer GCATCATGGTTgTTCAAGGCCA panjang 24 bp Tm 59.
Reverse Primer GCCGGCAACCAGcATTGTA panjang 21 bp Tm 59.
Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Kemudian kedua primer tersebut dianalisa dengan PerlPrimer, hasilnya kedua primer stabil (OIG O -.
namun masih memungkinkan terjadinya dimer antar primer.
Aligmenasi primer menunjukan spesifik untuk UCP2 Homo Pencarian mengenali mutasi Ala55Val UCP2 dengan memakai software REBASE dengan pilihan NEBcutter.
Mutasi Ala55Val terjadi pada ekson 4 .
isandi basa nukleotida urutan 507.
yang mengubah basa C posisi 544 dari sumber mRNA atau mengubah basa C posisi 9786 dari sumber genom.
Mutasi ini tidak menyebabkan perubahan splicing karena letak mutasi tidak berdekatan dengan intron atau ekson 3 .
Dengan memasukkan data fasta Artikel Penelitian genom atau mRNA ke dalam software didapatkan enzim retriksi untuk mutasi Ala55Val adalah CviKI-1.
Mutasi Ala55Val UCP2 dapat dideteksi dengan metode restriction fragmen length polymorphism (RFLP) menggunakan enzim retriksi CviKI-1 .
Enzim ini akan memotong situs antara basa G dan C dengan pola pemotongan blunt end.
Jika individu normal/wildtype maka situs GC dapat dikenali, jika individu mutan dengan perubahan C menjadi T maka situs GT .
tidak dapat dikenali enzim CviKI-1 (Gambar .
Selain enzim CviKI-1, mutasi Ala55Val UCP2 juga dapat dideteksi dengan enzim-enzim antara lain AfeI.
AleI.
AluI.
BsrBI.
BstUI,EcoRV.
HaeII dan HincII.
Gambar 12.
Refseq mRNA NM_003355 UCP2 Homo sapiens.
Titik mutasi berada pada posisi basa ke 544 yang mengubah basa C menjadi T.
Gambar 13.
Situs pengenal enzim CviKI-1.
Enzim retriksi CviKI-1 memotong ikatan antara basa G dan C.
Artikel Penelitian Majalah Kesehatan Pharmamedika 2013.
Vol 5 No.
Kesimpulan Gen
UCP2
Homo (NC_000011.
terdiri atas 8 ekson dan 7 intron dengan panjang basa nukleotida 8174 bp.
Protein UCP2 (NP_003.
mempunyai 309 asam amino, merupakan protein integral yang berlokasi di membran mitokondria bagian Struktur protein terdiri atas heliks dan Fungsi UCP2 sebagai protein transporter, uncoupling proton pada fosforilasi oksidatif, termogenesis dan keseimbangan energi dengan cara mengubah gradien proton.
Mutasi Ala55Val dapat dianalisis dengan mengamplifikasi target sekuen yang diinginkan dengan cara mendesain primer dan titik mutasi dideteksi dengan enzim retriksi yang mengenali titik tersebut.
Ala55Val merupakan mutasi missense yang terjadi di posisi mRNA ke 164, mengubah GCC menjadi GTC, mengubah translasi protein nomer 55 alanin menjadi valin.
Titik mutasi ini berdekatan dengan situs fosforilasi Protein C Kinase (PCK) protein, situs yang berperan mengatur jumlah ATP dalam proses termogenesis dan sekresi Informasi genetik gen, protein UCP2 serta peranannya dalam obesitas dan diabetes melitus tipe 2 dapat diperoleh dengan menggunakan database bioinformatika.
Daftar Pustaka