UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK ETANOL DAUN KRATOM
(Mitragyna speciosa Korth.
) DENGAN METODE MASERASI DAN
REFLUKS TERHADAP LARVA Artemia salina Leach Sri Winda Maulia1.
Siti Jubaidah 1.
Eka Siswanto S1 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Samarinda Email : sriwindamauliaa@gmail.
ABSTRACT
Kratom (Mitragyna speciosa Korth.
) is believed to have medicinal properties.
Kratom plants contain alkaloid chemical compounds, flavonoids, tannins, saponins, triterpenoids and several other chemical contents including Mitraginin which is suspected to have toxic effects.
The purpose of this study was to find out the toxic properties of kratom leaf ethanol extract against the larvae of Artemia salina Leach.
Know the value of Lethal Concentration 50 (LC.
ethanol extract kratom leaves.
Find out what compounds are contained in the ethanol extract of kratom leaves by the method of maceration and reflux.
The research conducted is experimental research with research stages namely plant determination, sampling, simplisia manufacturing, extract making of maceration and reflux methods, yield calculation, water content, phytochemical screening of kratom leaf ethanol extract, acute toxicity test with Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method, using Artemia salina Leach larvae aged 36-48.
BSLT testing to determine LC50 values with concentrations of 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 400 ppm and negative control.
The data analysis used is the probit analysis method.
The results showed that ethanol extract of kratom leaves positive method of maceration and reflux contains chemical compounds alkaloids, flavonoids, tannins, saponins, steroids / triterpenoids.
The yield of the maceration method extract is 34.
49% and the reflux method is 32.
The water content of the maceration method extract is 6.
5% and the water content of the reflux method is 8%.
The LC50 value obtained from the maceration method is 143.
50 ppm and the reflux method is 71.
08 ppm.
Ethanol extract of kratom leaves reflux maceration method indicates a toxic category against the larvae of Artemia salina Leach.
Keywords: Acute toxicity.
Mitragyna speciosa Korth.
Artemia salina Leach.
Brine Shrimp Lethality Test.
Lethal Concentration 50 (LC.
PENDAHULUAN
Kratom (Mitragyna Korth.
) merupakan tanaman tropis dari famili Rubiaceae yang berasal dari Asia Tenggara (Muang Thai.
Indonesia.
Malaysia.
Myanmar.
Filipin.
dan Papua Nugini.
Di Indonesia tanaman ini banyak tumbuh di Kalimantan .
Tumbuhan kratom mengandung senyawa kimia alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, fenol dan triterpenoid .
Secara empiris daun kratom memiliki beberapa khasiat sebagai obat herbal, diantaranya sebagai pada luka, obat meringankan nyeri otot, mengurangi nafsu makan, dan mengobati diare .
Namun selain memiliki khasiat untuk pengobatan kratom juga diduga memiliki efek toksik yang disebabkan oleh senyawa alkaloid .
Uji memberikan informasi awal tentang sifat bahan-bahan digunakan dalam obat tradisional yang sebelumnya tidak ada informasinya.
Informasi toksisitas akut digunakan dalam penentuan dosis penelitian, dosis terapi, serta secara akurat akan menjelaskan toksisitas tanaman obat.
Toksisitas menentukan nilai toksisitas akut Lethal Concentration50 (LC.
yang akan memberikan gambaran besarnya daya racun suatu ramuan.
Makin kecil nilai LC50 suatu zat, makin besar daya racun zat tersebut .
Pengujian toksisitas akut daun kratom menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan metode penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan Artemia salina Leach sebagai organisme uji memiliki kepekaan cukup tinggi terhadap zat yang bersifat toksik Berdasarkan latar belakang di atas, sebelum dilakukan uji toksisitas akut terlebih dahulu dilakukan proses ekstraksi dengan cara mengekstraksi serbuk simplisia daun kratom dengan menggunakan metode ekstraksi yang Metode maserasi merupakan metode ekstraksi cara dingin yang dilakukan dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari dengan beberapa kali pengadukan dan metode refluks merupakan suatu metode ekstraksi cara panas dengan adanya bantuan pendingin balik.
Kedua metode ini merupakan ekstraksi zat aktif yang sering digunakan dalam pembuatan Perbedaan bertujuan untuk mengetahui pengaruh metode ekstraksi terhadap rendemen ekstrak yang diperoleh dan metode yang efektif untuk mengekstraksi senyawa atau komponen kimia yang terkadung dalam sampel .
Ekstrak dari metode maserasi dan refluks dilakukan uji skrining fitokimia dengan tujuan untuk terkandung pada hasil ekstraksi tersebut.
Data toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach belum pernah dilaporkan sehingga perlu dilakukan penelitian tentang Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kratom (Mitragyna speciosa Korth.
) Dengan Metode Maserasi dan Refluks Terhadap larva Artemia salina Leach.
METODE PENELITIAN
Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimen.
Tahap penelitian ini dimulai dengan pengumpulan sampel, simplisia, ekstraksi metode maserasi dan refluks, penetapan rendemen, penetapan susut pengeringan, skrining fitokimia, penyiapan air laut, penetasan telur Artemia salina Leach, penyiapan kontrol negatif, konsentrasi dosis, analisis PROSEDUR PENELITIAN Pembuatan Simplisia Sampel yaitu daun kratom yang diperoleh dari Desa Kota Bangun Seberang.
Kecamatan Kota Bangun.
Kabupaten Kutai Kartanegara.
Determinasi dilakukan di Laboratorium Fisiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda.
Daun kratom yang telah dikumpulkan disortasi basah, dicuci dengan air mengalir, ditiriskan, dilakukan pengeringan.
Simplisia utuh dihaluskan dengan blender dan diayak menggunakan mesh 60 sehingga diperoleh serbuk simplisia.
Pembuatan Ekstrak Ekstraksi Dengan Metode Maserasi Diambil serbuk simplisia daun kratom ditimbang 100 gram, kemudian dimaserasi dalam wadah kaca dengan pelarut etanol 70% sebanyak 1 L dan dilakukan pengadukan selama 3 jam pertama menggunakan pengaduk kinetik, kemudian didiamkan kurang lebih 18 Selanjutnya, dilakukan penyaringan dan ampas di remaserasi kembali dengan pelarut etanol 70% sebanyak 1 L, diaduk kembali selama 3 jam pertama Hasil remaserasi disaring sehingga didapat maserat, lalu cairan diuapkan di atas penangas air sampai diperoleh ekstrak kental .
Ekstraksi Dengan Metode Refluks Ekstraksi menggunakan metode refluks.
Diambil serbuk daun kratom ditimbang sebanyak 100 gram, lalu dimasukkan ke dalam labu alas bulat dan ditambahkan pelarut etanol 70% sebanyak 1 L dan dipanaskan pada suhu 60oC selama 3 jam, dilakukan penyaringan dan ampas di refluks kembali dengan pelarut etanol 70% sebanyak 1 L, dipanaskan pada suhu 60oC selama 3 jam.
Hasil yang didapat disaring, lalu cairan diuapkan di atas penangas air sampai diperoleh ekstrak kental .
Penetapan Rendemen Rumus perhitungan rendemen :
% Rendemen Penetapan Kadar Air Ekstrak Penentuan kadar air dilakukan dengan menimbang ekstrak sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam cawan poselin yang telah ditimbang.
Ekstrak dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 30 menit dan dikeringkan pada suhu penetapan sampai diperoleh bobot Didinginkan desikator kemudian dicatat bobot tetap yang diperoleh.
Penetapan kadar air menggunakan rumus :
% Kadar air = Keterangan:
a= Berat cawan kering.
b = Berat sampel awal.
c = Berat cawan sampel.
Skrinning Fitokimia Skrining penelitian ini meliputi uji alkaloid, fenolik, saponin, tannin, terpenoid, steroid dan flavonoid.
Air Laut
Air laut diperoleh dari Pantai Pemedas Samboja di jalan BalikpapanAe Handil
II,
Kecamatan Samboja.
Kabupaten Kutai Kartanegara.
Kalimantan Timur.
Air laut yang akan digunakan terlebih dahulu diperiksa pH airnya, apabila pH < 7, maka air laut ditambahkan natrium bikarbonat sampai mencapai pH > 7.
Penetasan Telur Artemia salina Leach Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur Artemia salina Leach 100%.
sebanyak 50 mg pada wadah yang berisi air laut sebanyak 250 mL.
dengan diberi penerangan cahaya lampu pijar 40 watt agar suhu penetasan 25Ae30oC.
Telur larva tersebut dibiarkan selama 24 jam sampai menetas menjadi nauplii yang matang dan siap digunakan untuk percobaan.
Penyiapan Kontrol Negatif Kontrol negatif dibuat dengan tanpa menambahkan ekstrak, kemudian ditambahkan 10 mL air laut dan 10 ekor larva udang Aretmia salina Leach ke dalam vial.
Konsentrasi Dosis Ekstrak daun kratom yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 50, 100, 200 dan 400 ppm.
Prosedur Uji Toksisitas Akut Metode Brine Shrimp LetalityTest (BSLT) Disiapkan vial untuk masingmasing konsentrasi, disediakan 15 vial dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
Vial ditambahkan air laut sebanyak 10 mL.
Sepuluh ekor larva Aretmia salina Leach dipindahkan ke dalam masing-masing vial yang telah berisi senyawa uji.
Kontrol negatif diberi perlakuan yang sama larutan uji tetapi tidak ditambahkan dengan ekstrak.
Vial-vial tersebut diletakkan di bawah penerangan.
Jumlah larva udang yang mati dalam tiap vial dihitung selama 24 jam dengan cara Tingkat toksisitas ditentukan dengan menghitung jumlah larva yang Kriteria standar untuk menilai kematian larva udang adalah bila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik observasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil memiliki klasifikasi spesies Mitragyna speciosa Korth.
Dengan nama indonesia yaitu kratom, puri.
Daun kratom yang telah dikumpulkan disortasi basah untuk memisahkan kotoran dan benda asing yang menempel pada sampel, kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan sisa kotoran yang masih menempel pada daun Daun yang telah dicuci selanjutnya ditiriskan terlebih dahulu kemudian dilakukan pengeringan.
Daun dikeringkan dengan cara dianginanginkan.
Simplisia yang sudah kering dihaluskan dan diayak menggunakan ayakan mesh 60 untuk memperoleh serbuk yang lebih halus.
Ekstraksi Tumbuhan Kratom Proses ekstraksi daun kratom dilakukan dengan menggunakan dua metode ekstraksi yang berbeda yaitu cara dingin dengan metode maserasi dan cara panas dengan metode refluks.
Perbedaan mengetahui pengaruh metode ekstraksi dihasilkan dan metode yang efektif menarik senyawa atau komponen kimia yang terdapat dalam sampel.
Hasil dari kedua metode ekstraksi yang dilakukan yaitu metode maserasi dan metode refluks didapatkan rendemen metode maserasi yaitu 34,49% dan rendemen metode refluks yaitu 32,1%.
Penetapan Kadar Air Penetapan kadar air merupakan parameter yang digunakan untuk menentukan residu air yang terdapat dalam bahan setelah proses pengeringan.
Tabel 1.
Hasil Penetapan Kadar Air Metode Maserasi dan Refluks.
Hasil
Uraian Maserasi
Refluks Kadar Air
6,5 %
Hasil penetapan kadar air ekstrak daun kratom yang diperoleh pada metode maserasi yaitu 6,5% dan pada metode refluks yaitu 8%.
Menurut Voight .
, parameter ekstrak yaitu untuk ekstrak cair lebih dari 30%, ekstrak kental 5-30% dan untuk ekstrak kering kurang dari 5%.
Kadar air ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks yang diperoleh memenuhi persyaratan dari parameter ekstrak kental yaitu 5- Kadar air yang besar dapat menyebabkan pertumbuhan mikroba pertumbuhan mikroorganisme dan juga sebagai media terjadinya reaksi enzimatis yang dapat menguraikan senyawa aktifnya .
Skrining Fitokimia Uji skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks.
Tabel 2.
Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Kratom Metode Maserasi dan Refluks.
Hasil Golongan Ket.
Metabolit Sekunder Maserasi Refluks Alkaloid Mayer Bouchardat Dragendorf Endapan putih Endapan coklat Endapan putih Endapan coklat Endapan merah bata Endapan merah bata Terbentuk warna Terbentuk warna kuning pada lapisan kuning pada lapisan amil alkohol amil alkohol Larutan hijau Larutan hijau Tanin Terbentuk busa 1 cm.
Terbentuk busa 1 cm.
Saponin penambahan HCl 2N penambahan HCl 2N tidak hilang tidak hilang Terbentuk warna biru Terbentuk warna biru Triterpenoid/Steroid Keterangan :
dragendorf menunjukan hasil positif pada : mengandung senyawa kimia.
ke 3 uji yang dilakukan.
Pada uji Hasil skrining fitokimia dari flavonoid ekstrak etanol daun kratom ekstrak etanol daun kratom pada tabel diatas positif mengandung senyawa menunjukkan hasil positif mengandung metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid karena pada lapisan amil alkohol berwarna kuning.
Uji tanin triterpenoid/steroid.
ekstrak etanol daun kratom metode Pada uji alkaloid ekstrak etanol maserasi dan refluks pada penambahan 1 daun kratom metode maserasi dan refluks tetes FeCl3 1% menghasilkan larutan dengan pereaksi mayer, bouchardat, dan berwarna hijau kehitaman, menunjukkan Flavonoid positif mengandung senyawa tanin.
Uji senyawa saponin dilakukan pada ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks menghasilkan busa yang stabil dan tidak hilang dengan penambahan HCl 2N.
Uji senyawa Triterpenoid/steroid dilakukan pada ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks membentuk warna hijau kebiruan pada saat penambahan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat, menunjukkan mengandung senyawa triterpenoid.
Uji Toksisitas Akut Metode Brine Shrimp LetalityTest (BSLT) Telur udang Artemia salina Leach yang akan digunakan sebagai hewan uji dibiakkan menggunakan air laut selama 18-36 jam.
Hal penting yang harus diperhatikan yaitu pH pada air laut yang Hal ini berguna pada proses pecahnya lapisan tipis dipengaruhi oleh enzim penetas, dimana enzim ini pada pH >7 mempunyai aktivitas yang optimum Penetasan telur larva Artemia salina Leach dilengkapi dengan aerator untuk menjaga kadar oksigennya dan diberi penerangan menggunakan lampu 40 watt dengan suhu 25-30oC .
Penyinaran cahaya lampu 40 watt berfungsi untuk menghangatkan suhu dalam wadah penetasan dan merangsang pengaktifan dari perkembangan embrio dalam Artemia salina Leach bersifat fototoksik yang berarti menyukai Larva Artemia salina Leach siap dijadikan hewan uji setelah 36-48 jam.
Larva Artemia salina Leach yang digunakan pada percobaan yaitu larva yang berusia 36-48 jam.
Hal ini disebabkan karena setelah berumur 24 jam larva akan memasuki fase instar II dimana sudah memiliki mulut dan sistem pencernaannya telah sempurna, sehingga ekstrak yang ada di lingkungan larva masuk ke dalam tubuh larva dan menyebabkan kematian larva.
Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan larva yang berumur 36Ae48 jam.
Ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks dibuat larutan stok sebesar 1000 ppm dengan cara melarutkan 0,1 gram ekstrak dilarutkan dengan air laut, apabila ekstrak tidak larut maka ditambahkan pelarut dimethyl sulfoxide (DMSO).
Penambahan DMSO bertujuan untuk menambah kelarutan ekstrak dan tidak bersifat toksik.
Hasil dari orientasi dosis didapatkan variasi konsentrasi uji yaitu 50, 100, 200, dan 400 ppm, dengan ditambahkan 0 ppm sebagai kontrol Kontrol negatif berupa air laut dan larva udang tanpa penambahan Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut maupun faktor lain terhadap kematian larva.
Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva akibat dari penambahan ekstrak yang dilakukan.
Larutan stok ekstrak etanol daun kratom metode maserasi dan refluks dilakukan uji toksisitas.
Larutan seri yang telah dibuat kemudian diuji dengan memasukkan 10 ekor larva ke dalam masing-masing vial ditambahkan air laut sebanyak 10 ml.
Setiap konsentrasi dilakukan reflikasi sebanyak 3 kali dengan tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih akurat.
Pembuatan kontrol negatif menggunakan air laut yang berisi 10 ekor larva Artemia salina Leach dengan perlakuan yang sama.
Diamati dan dihitung jumlah larva Artemia salina Leach yang mati dalam tiap vial selama 24 jam.
Toksisitas ditentukan dengan melihat harga LC50 yang dihitung berdasarkan analisis probit.
LC50 dihitung dengan memasukkan log menggunakan regresi liniear sederhana pada program Microsoft Excelsehingga diperoleh kurva grafik.
Tabel 3.
Hasil Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kratom (Mitragyna speciosa Korth.
) Dengan Metode Maserasi
Perlakuan Jumlah Persentase Log
Rata-rata Rata-rata Konsentrasi
Kematian Kematian(%) (X) Konsentrasi
i Jumlah Kematian Probit
(Y)
0 ppm
50 ppm
1,699
4,36
100 ppm
2,000
4,64
200 ppm
2,301
5,15
400 ppm
2,602
5,71
LC50
143,50 Tabel 4.
Hasil Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kratom (Mitragyna speciosa Korth.
) Dengan Metode Refluks.
Perlakuan Jumlah Persentase Log
Rata-rata Rata-rata Konsentrasi
Kematian Kematian (%) (X) Konsentrasi
i Jumlah Kematian 0 ppm
50 ppm
1,699
4,82
100 ppm
2,000
5,08
200 ppm
2,301
5,41
400 ppm
2,602
5,95
Berdasarkan toksisitas akut ekstrak etanol daun kratom dengan metode maserasi dan refluks diperoleh hasil bahwa kontrol negatif konsentrasi 0 ppm tanpa ekstrak pada percobaan tidak ditemukan adanya Artemia salinaLeach.
Peningkatan konsentrasi yang bervariasi pada setiap vial uji yang dilakukan dengan penambahan ekstrak dari metode maserasi dan refluks konsentrasi 0, 50, 100, 200, dan 400 ppm memiliki pengaruh yang berbeda pada kematian larva Artemia salina Leach.
Hal Probit
(Y)
LC50
71,08 ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kratom memberikan efek toksik terhadap larva Artemia salina Leach dan dapat menjadi indikasi awal dari efek farmakologi yang terkandung dalam ekstrak daun kratom.
Kematian pada larva Artemia salina Leach disebabkan karena perubahan gradien konsentrasi yang drastis antara di luar dan di dalam sel sehingga menyebabkan senyawa toksik mampu menyebar dengan baik ke tubuh Artemia salina Leach.
Efek kerusakan metabolisme yang ditimbulkan terjadi secara cepat dapat dideteksi dalam waktu 24 jam, hingga menyebabkan 50% kematian larva Artemia salina Leach .
Hasil dari persentase kematian menggunakan program Microsoft Excel, dilakukan analisis nilai probit dengan menggunakan tabel probit, kemudian dicari log dari konsentrasi ppm hasil yang didapat dari log konsentrasi .
dihubungkan dengan nilai probit .
, kemudian dilakukan analisis data dengan rumus y = a bx, nilai y = 5 .
ilai 5 didapat dari tabel probit yang mewakili 50% kematian hewan uj.
, a merupakan hasil dari intercept dan b merupakan hasil dari log konsentrasi.
Hasil dari y = a bx merupakan nilai dari x, untuk mendapatkan nilai LC50 maka nilai x sama dengan antilog .
Dibuat kurva persamaan garis lurus dari log konsentrasi .
dengan nilai probit .
untuk memperoleh persamaan regresi Hasil dari analisis data regresi dan persamaan regresi linear akan didapatkan nilai koefisisen korelasi .
, koefisisen korelasi merupakan ukuran yang dipakai untuk mengetahui derajat hubungan antara dua variabel X dan Y.
Probit Analisis Probit dan LC50 Metode Maserasi 602, 5.
301, 5.
000, 4.
699, 4.
0, 3.
y = 0.
RA = 0.
Konsentrasi Gambar 1.
Grafik Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Kratom Metode Maserasi.
Probit Analisis Probit dan LC50 Metode Refluks 602, 5.
699,2.
0, 3.
y = 1.
RA = 0.
Konsentrasi Gambar 2.
Grafik Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Kratom Metode Refluks.
Nilai koefisisen korelasi yang didapat dari metode maserasi yaitu r = 0,9783 dan metode refluks yaitu r = 0,9966 menggambarkan bahwa antara variabel konsentrasi (X) dan probit (Y) mempunyai hubungan positif, karena kedua metode maserasi dan refluks mempunyai nila koefisisen korelasi mendekati 1 yang artinya korelasi positif Koefisien korelasi berkaitan dengan persamaan regresi karena persamaan regresi mewakili persamaan hubungan antara dua atau lebih variabel, jika hubungan dua variabel liniear sempurna maka sebaran data tersebut akan membentuk garis lurus.
Hasil dari analisis data kedua metode ekstraksi maserasi dan refluks didapatkan nilai LC50 metode maserasi yaitu 143,50 ppm lebih besar dibandingkan dengan nilai LC50 metode refluks yaitu 71,08 ppm.
Menurut Wagner.
suatu senyawa dikatakan bersifat sangat toksik jika nilai LC50 <30 ppm, toksik jika nilai LC50 30-1000 ppm dan tidak toksik jika nilai LC50>1000 Hasil nilai LC50 yang diperoleh dari metode maserasi dan refluks berada pada tingkat nilai toksisitas <1000 ppm, hasil ini termasuk dalam kategori bersifat toksik terhadap Artemia salina Leach.
Suatu ekstrak termasuk dalam kategori toksik dan memiliki potensi sebagai antikanker jika mempunyai nilai LC50 masuk dalam rentang 30-1000 ppm Keberadaan senyawa metabolit dimanfaatkan sebagai agen biolarvasida dan antikanker.
Hal tersebut berkaitan dengan senyawa yang terdapat dalam ekstrak etanol daun kratom yaitu alkaloid, flavonoid, tanin, saponin dan terpenoid/steroid, dimana pada kadar tertentu memiliki potensi toksisitas serta dapat menyebabkan kematian larva Artemia salina Leach.
Cara kerja senyawa-senyawa tersebut adalah dapat bertindak sebagai racun perut .
tomach poisonin.
yang mengganggu alat penceraan larva dan menghambat reseptor perasa pada mulut larva.
Akibatnya larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya yang kemudian menyebabkan kematian larva Artemia salinaLeach.
KESIMPULAN
Nilai LC50 ekstrak etanol daun kratom (Mitragyna speciosa Korth.
) metode refluks sebesar 71,08 dibandingkan dengan metode maserasi sebesar 143,50 ppm.
Ekstrak etanol daun kratom (Mitragyna speciosa Korth.
metode maserasi dan refluks bersifat toksik terhadap larva Artemia Salina Leach.
DAFTAR PUSTAKA