Jurnal Mina Sains ISSN: 2407-9030 Volume 5 Nomor 2.
Oktober 2019 PENERAPAN SISTEM AKTIVASI CRISPR (CRISPR.
PADA GEN-GEN IKAN ZEBRA (Danio reri.
APPLICATION OF CRISPR ACTIVATION (CRISPR.
SYSTEM TO ZEBRAFISH (Danio reri.
GENES Rizka Rahmana Putri Staf Pengajar Program Studi Akuakultur.
Fakultas Pertanian.
Universitas Djuanda Email: rizka.
rahma@unida.
ABSTRACT
CRISPR activation system is part of the function of CRSPR/Cas9 which is used to manipulate certain genes by activating these genes.
CRISPR activation utilizes dCas9 .
eadCas.
or Cas9 which is deactivated as DNA scissors, so that the use of Cas9 for gene activation does not cause targeted DNA chain termination.
This research that uses this CRISPR activation is applied to the zebrafish gene (Danio reri.
aims to determine the mRNA level of the targeted In this study, the ASCL1a and BCL6a genes from zebrafish were targeted as the object of study.
The results showed that genes from zebrafish that were targeted had an increase in mRNA levels after being activated using CRISPR activation system.
Keywords: CRISPR activation system (CRISPR.
, zebrafish (Danio reri.
, dCas9.
ASCL1a
BCL6a gene
ABSTRAK
Sistem aktivasi CRISPR (CRISPR.
merupakan bagian dari fungsi dari pengedit genom CRSPR/Cas9 yang digunakan untuk memanipulasi gen tertentu dengan cara mengaktifkan gen Aktivasi CRISPR memanfaatkan dCas9 .
ead-Cas.
atau Cas9 yang dinonaktifkan fungsinya sebagai gunting DNA, sehingga penggunaan Cas9 untuk aktivasi gen tidak menimbulkan pemutusan rantai DNA yang ditarget.
Penelitian yang menggunakan aktivasi CRISPR ini diterapkan pada gen ikan zebra (Danio reri.
bertujuan untuk mengetahui tingkat espresi mRNA dari gen yang ditarget.
Pada penelitian ini mentargetkan gen ASCL1a dan BCL6a dari ikan zebra sebagai objek yang diteliti.
Hasil menunjukkan bahwa gen-gen dari ikan zebra yang ditargetkan mengalami peningkatan level mRNA setelah diaktifkan menggunakan sistem aktivasi CRISPR.
Kata kunci: sistem aktivasi CRISPR (CRISPR.
, ikan zebra (Danio reri.
, dCas9, gen ASCL1a, gen BCL6a Rizka Rahmana Putri.
Penerapan Sistem Aktivasi CRISPR (CRISPR.
pada Gen-Gen Ikan Zebra (Danio reri.
Jurnal Mina Sains 5.
: 93 Ae 99.
PENDAHULUAN
CRISPR/Cas9 adalah singkatan dari Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, merupakan sistem yang sekarang ini dikembangkan sebagai teknologi yang canggih untuk mengedit genom dan Penggunaan CRISPR/Cas9 pengamatan aktivasi gen, kemudian dinamakan sistem aktivasi CRISPR (CRISPR.
Sistem CRISPRa nuclease-dead Cas9 .
Cas.
untuk mencegah fungsi Cas9 sebagai gunting DNA, sehingga sistem dapat diterapkan tanpa mengubah urutan Penerapan Sistem Aktivasi CRISPR Putri Dalam sel eukariotik, dCas9 menyatu dengan aktivator seperti p65 atau aktivator VP64, yang diklasifikasikan ke dalam generasi pertama aktivator dCas9.
Selain itu, penggunaan sgRNA .
ingle guide-RNA) merupakan faktor penting yang digunakan dalam metode CRISPR.
Metode CRISPR/Cas9 ini telah banyak digunakan untuk memodifikasi gen pada beberapa model, termasuk zigot hewan dan sel manusia.
Namun, penerapannya ke ikan masih perlu dieksplor lebih lanjut.
Penelitian ini membawa gen-gen pada ikan zebra (Danio reri.
sebagai objek penelitian dan menerapkan metode gene editing CRISPR untuk memanipulasi aktivasi gen pada ikan.
LANDASAN TEORI
CRISPR adalah alat yang sangat fleksibel untuk memanipulasi genom karena enzim Cas mengikat DNA target secara independen dari kemampuan mereka untuk memotong DNA target.
Sistem CRISPR/Cas9 dari Streptococcus pyogenes direkayasa ulang agar berfungsi dalam sel sebagai faktor transkripsi.
Tidak seperti sistem sebelumnya yang menggunakan Zinc Finger Proteins (ZFP.
yang dapat diprogram (Beerli et al.
atau Transcription Activator-Like Effector (TALE.
(Konermann et al.
Miller et Zhang et al.
untuk menargetkan situs tertentu dalam genom, sistem CRISPR/Cas9 diarahkan ke DNA urutan oleh guide RNA .
RNA) (Jinek et Dengan demikian menargetkan sistem CRISPR/Cas9 ke urutan DNA tertentu hanya membutuhkan urutan pendek gRNA dan tidak melibatkan rekayasa ulang dari domain pengikatan DNA protein.
Untuk mengkonversi Cas9 dari fungsinya sebagai gunting DNA menjadi aktivator gen, perlu untuk menonaktifkan aktivitas nuclease-nya.
Secara khusus, kedua domain RuvC- dan HNH-nuclease dapat dibuat tidak aktif oleh katalitik titik endonuklease Cas9 (D10A dan H840A dalam SpCas.
, menghasilkan Cas9 yang fungsi nucleasenya tidak dapat merusak DNA target.
Dalam sel eukariotik, generasi pertama dCas9 dapat dikonversi menjadi aktivator VP64 .
etramer yang direkayasa dari domain aktivator transkripsi herpes simplex VP.
atau domain aktivasi p65 (Cong et al.
Gilbert et al.
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources.
Shanghai Ocean University.
Shanghai.
Cina pada bulan Februari Ae Juni 2018.
Bahan dan Metode Plasmid Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini antara lain dCas9-VP64 yang mengandung dCas9 dan aktivator VP64, pSPgRNA yang mengandung single guide RNAs .
gRNA.
sgRNA yang mengandung sekuens DNA dari gen ikan
CRISPR-ERA
http://CRISPR- ERA.
edu (Liu et Kami menggunakan promoter aktin yang berasal dari ikan zebra untuk membuat aktin-sgRNA.
Urutan target gen ikan zebra yang bersebelahan dengan sgRNA disisipkan ke dalam vektor Tol2 menggunakan metode Q5 Site-Directed Mutagenesis (NEB).
Vektor Tol2 adalah vektor transgenik berbasis transposable tol2 yang mengandung promoter aktin dari ikan zebra.
Vektor ini telah dimodifikasi dari pEGFP-N1 dan berisi Multiple Cloning Sequences (MCS) diikuti oleh urutan pengkodean EGFP, diapit oleh lengan transposon Tol2 (Hu et Perancang primer dan protokol metode Qiagen Site-Directed Mutagenesis tersedia di http://nebasechanger.
Daftar sgRNA yang menargetkan gen manusia dan ikan zebra dilampirkan dalam Tabel 1.
Jurnal Mina Sains ISSN: 2407-9030 Volume 5 Nomor 2.
Oktober 2019 Tabel 1.
sgRNA yang didesain menggunakan CRISPR-ERA
Gen yang Nomor
Sekuens Strand
Jarak ke TSS
sgRNA ke-1
sgRNA ke-2
sgRNA ke-3
sgRNA ke-4
sgRNA ke-1
sgRNA ke-2
sgRNA ke-3
sgRNA ke-4
ACGCAACGCAAGCGTATCTC
TGtACTCAGTGGCAGGAG
CACACAATGAGCTGCAATGA
TATAAGAACGGTGCATGTCT
TCAATTCTCGGAAtGAGC
GtAATTCCTCCTCTCTAA
CCAGACAGAGACGGTCACGT
AGTTCTGAGTAtGAGGC Kultur sel Sel embrionik embrio ZF4 diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC).
Sel-sel ZF4 dikultur pada suhu 28AC dan 5% CO2, dalam DME / F-12 (Hyclon.
dicampur dengan 10% FBS (Gibc.
dan 1% Penicillin- streptomycin (Hyclon.
Transfeksi ke sel ZF4 Metode transfeksi non-virus untuk mentransfer plasmid DNA ke dalam sel ZF4 yang digunakan dalam penelitian ini adalah transfeksi berbasis elektroporasi atau Nucleofeksi (Lonz.
Semua transeksi, kami menggunakan Amaxa SG Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L (Lonz.
, 4DNucleofector Unit X dengan 100 L Nucleocuvette vessel dan program DS-134, plate 6-well (Greine.
, plasmid aktinsgRNA yang mengandung urutan sekuens target dari gen ASCL1a dan BCL6a, konsentrasi masing-masing plasmid DNA adalah 1 g/l, per sampel mengandung 2,3 l jumlah total DNA yang dicampur dengan 100 l solusi Nucleofector dalam sel ZF4, vektor pmaxGFP digunakan sebagai Fluoresensi mikroskop Zeiss Axiocam dan X-Cite Series 120 Lumen Dynamics pada 7 dan 17 jam pasca-Nukleofeksi (Putri & Chen.
Jelasnya, plasmid dCas9-VP64 dan plasmid sgRNA kami campur hingga total DNA 2,3 l.
Untuk penggunakan 2 sgRNA, kami menggunakan ratio 1:1 untuk masingmasing sgRNA, demikian juga dengan penggunaan 4 sgRNA, kami menggunakan ratio 1:1:1:1.
Untuk kelompok kontrol, kami menggunakan sel ZF4 wild type .
el yang masih orisini.
Kemudian jumlah total DNA 2,3 l yang dicampur dengan 100 l solusi Nucleofector dalam 1.
sel ZF4.
Setelah proses Nukleofeksi, sel diinkubasi selama 0, 3, 6, 12 jam pada suhu 28AC di dalam inkubator CO2 5%.
RT dan qPCR Total RNA diisolasi menggunakan TRizol dan sintesis cDNA dilakukan menggunakan kit reagen PrimeScript RT dengan gDNA Eraser (Takar.
qPCR dilakukan menggunakan SYBR Green I Master dan LightCycler 480 II (Roch.
Primer
qPCR
NCBI
Primer-BLAST .
ttps://w.
gov/tools/prime r-blast/) dengan berbagai produk PCR ukuran 70-150 bp.
Spesifisitas primer dikonfirmasi oleh elektroforesis gel Primer dilaporkan dalam Tabel 2.
Penghitungan kuantifikasi relatif dan metode iiCt.
Hasilnya dinyatakan sebagai lipatan peningkatan ekspresi mRNA dari gen yang dinormalisasi menjadi ekspresi GAPDH.
Nilai yang dilaporkan adalah mean dan standar deviasi dari tiga percobaan independen yang dilakukan pada hari yang berbeda .
= .
dengan duplikat teknis untuk setiap percobaan.
Penerapan Sistem Aktivasi CRISPR Putri Table 2.
Primer qPCR yang digunakan untuk mengukur tingkat mRNA pada gen target
Gen yang ditarget ASCL1
BCL6a
GAPDH
Forward AACCgTGAAGCTTGTGA CGAGTGACGGTAACAAc TTCCAGTACGACTCCAc Statistik Data disajikan sebagai mean A SD .
tandard deviatio.
dan evaluasi statistik untuk analisis data ditentukan dengan uji ANOVA one way dan Tukey menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 8.
p<0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Program DS-134 pada Nukleofeksi adalah program terbaik untuk mentransfeksi plasmid ke dalam sel ZF4.
Efisiensi transfeksi meningkat hingga 60% dari 7 jam menjadi 17 jam pasca-Nukleofeksi (Putri & Chen, 2.
Kami pmaxGFP sebagai positif kontrol yang menunjukkan berhasil atau tidaknya transfer plasmid ke dalam sel ZF4.
Kami menggunakan promotor aktin ikan zebra dari -aktin yang terkait erat dengan RNA Polymerase i (Hu et al.
untuk mendorong ekspresi gRNA.
Hasil dari penghitungan mRNA menunjukkan bahwa tingkat ekspresi mRNA dari gen ASCL1a menggunakan 2 sgRNA lebih rendah dibanding dengan 4 sgRNA.
Penggunaan 4 sgRNA menginduksi aktivasi gen ikan zebra dan mampu menyebabkan efek sinergis dalam menginduksi ekspresi level mRNA.
Dalam aktivasi gen ASCL1a, penghitungan jumlah level ekspresi mRNA yang diaktivasi menggunakan 2 sgRNA menunjukkan bahwa setelah inkubasi selama 6 jam, mRNA meningkat hanya 1 kali lipat dibanding dengan wild type .
(Gambar 1A).
Setelah 12 jam, level mRNA meningkat hanya pada angka 2,1 .
<0,.
Sedangkan pengamatan tingkat mRNA yang menggunakan 4 sgRNA (Gambar 1B) menunjukkan setelah diinkubasi selama 3 jam mRNA meningkat sebanyak 3 kali lipat dari kontrol yaitu 3,3 Reverse TCATCTTCTTGTTGGCCGCT CCAGCTcTGGAGGAGTA ATCAATGACCAGtGCCG .
<0,.
Setelah diinkubasi selama 6 jam level mRNA meningkat pada angka 6,2 .
<0,.
dan setelah 12 jam, mRNA meningkat ke angka 8,3 .
<0,.
Hasil perbandingan dengan metode ANOVA one way dan Tukey menunjukkan bahwa peningkatan mRNA yang diaktivasi meggunakan 4 sgRNA cukup signifikan.
Kami juga membandingkan perubahan ekspresi level mRNA antara penggunaan 2 sgRNA dengan 4 sgRNA.
Hasil sgRNA menginduksi aktifitas mRNA dari gen ikan zebra lebih kuat disbanding hanya menggunakan 2 sgRNA, sehingga ekspresi level mRNA berbeda secara signifikan .
<0,.
setelah diinkubasi selama 12 jam (Gambar 3A).
Dalam aktivasi gen BCL6a, sel ZF4 yang ditransfeksi dengan dCas9-VP64 dan 2sgRNA (Gambar 2A), setelah dihitung mRNA-nya peningkatan yang signifikan dibandingkan dengan control setelah 6 jam inkubasi yaitu 5,5 dan setelah 12 jam, mRNA meningkat pada angka 7,2 dibanding kontrol.
Sedangkan penghitungan ekspresi level mRNA dari sel yang ditransfeksi dengan dCas9-VP64 dan 4 sgRNA, mRNA mengalami peningkatan .
<0,.
, dibandin control setelah 3 jam inkubasi, yaitu 2,2.
Ekspresi mRNA terus meningkat secara signifikan .
<0,.
setelah 6 jam dan 12 jam, yaitu 7,2 dan 9,4 (Gambar 2B).
Perbandingan ekspresi level mRNA dari sel yang diaktivasi menggunakan dCas9-VP64 2sgRNA, dan dCas9 4 sgRNA dapat dilihat pada Gambar 3B.
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa 4 sgRNA mampu meningkatkan ekspresi level mRNA .
<0,.
2sgRNA.
Jurnal Mina Sains ISSN: 2407-9030 Volume 5 Nomor 2.
Oktober 2019 ASCL1a ASCL1a Ekspresi mRNA WT .
dCas9-VP64 2 sgRNA Ekspresi mRNA WT .
dCas9-VP64 4 sgRNA Lama Inkubasi .
Lama Inkubasi .
Gambar 1.
Ekspresi level mRNA dari gen ikan zebra (Danio reri.
yang diaktivasi menggunakan Aktivasi CRISPR (CRISPR.
(A) Sel ZF4 ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung dCas9-VP64 dan 2 sgRNA yang mentarget sekuens dari gen ASCL1a.
(B) Sel ZF4 ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung dCas9-VP64 dan 4 sgRNA yang mentarget sekuens dari gen ASCL1a.
** p<0,01.
ns not significant.
BCL6a BCL6a WT .
Ekspresi mRNA dCas9-VP64 2 sgRNA Ekspresi mRNA WT .
dCas9-VP64 4 sgRNA Lama Inkubasi .
Lama Inkubasi .
Gambar 2.
Ekspresi level mRNA dari gen ikan zebra (Danio reri.
yang diaktivasi menggunakan Aktivasi CRISPR (CRISPR.
(A) Sel ZF4 ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung dCas9-VP64 dan 2 sgRNA yang mentarget sekuens dari gen BCL6a.
(B) Sel ZF4 ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung dCas9-VP64 dan 4 sgRNA yang mentarget sekuens dari gen BCL6a.
* p<0,05.
** p<0,01.
ns not significant.
ASCL1a dCas9-VP64 2 sgRNA dCas9-VP64 4 sgRNA Ekspresi mRNA Ekspresi mRNA BCL6a dCas9-VP64 2 sgRNA dCas9-VP64 4 sgRNA Lama Inkubasi .
Lama Inkubasi .
Gambar 3.
Perbandingan ekspresi level mRNA dari gen-gen ikan zebra (Danio reri.
ASCL1a (A) dan BCL6a (B) yang sel-sel ZF4 ditransfeksi dengan dCas9-VP64 2 sgRNA dengan sel-sel yang ditransfeksi dengan dCas9 4 sgRNA.
* p<0,05.
** p<0,01.
*** p<0,001.
ns not significant.
Penerapan Sistem Aktivasi CRISPR
Putri
KESIMPULAN
CRISPR/Cas9 yang telah banyak digunakan untuk memodifikasi gen pada beberapa model, termasuk zigot hewan dan sel manusia, namun, penerapannya ke ikan masih belum diketahui.
Kesimpulan dari hasil penelitian ini adalah Aktivasi CRISPR (CRISPR.
mampu menginduksi aktifitas gen-gen pada ikan zebra (Danio reri.
Hal ini terlihat dari adanya peningkatan ekspresi level mRNA setelah sel ZF4 ditransfeksi dengan plasmid dCas9-VP64 dan sgRNA.
Hasil penelitian ini dapat dijadikan sebagai rujukan dalam CRISPR/Cas9 untuk penelitian-penelitian selanjutnya di bidang rekayasa genetika
UCAPAN TERIMAKASIH
Kami mengucapkan terimakasih kepada tim riset Prof.
Chen Liangbiao yang telah memberikan pengarahan dalam melakukan penelitian ini dan penelitian ini didanai oleh Natural Science Foundation of China dan Major Science Innovation dari Shanghai Education Committee untuk L.
DAFTAR PUSTAKA