ANALISIS POLA PITA PROTEIN Cymbidium mosaic virus
PADA Protocorm likes bodies ANGGREK DENDROBIUM
JAYAKARTA DAN TANAMAN ANGGREK
DENDROBIUM MENGGUNAKAN METODE
ELEKTROFORESIS GEL KOMPOSIT
Melissa Syamsiah.
Pd* RINGKASAN Cymbidium mosaic virus (CyMV) merupakan salah satu virus patogen yang dominan menginfeksi tanaman anggrek di Dunia.
Deteksi infeksi CyMV dapat dilakukan dengan metode DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assa.
Untuk lebih memastikan lagi bahwa virus yang menginfeksi tanaman anggrek tersebut adalah CyMV, maka dapat dilakukan pembedaan pola pita protein menggunakan metode Elektroforesis Gel Komposit.
Penelitian ini bertujuan untuk membedakan pola pita protein tanaman anggrek Dendrobium yang sehat atau bebas CyMV dengan pola pita tanaman yang sakit .
erinfeksi CyMV).
Hasil penelitian menunjukan bahwa analisis dengan teknik Elektroforesis Gel Komposit dapat digunakan untuk membedakan pita protein CyMV pada tanaman dan plbs anggrek Dendrobium yang sakit atau positif terinfeksi CyMV dengan tanaman atau plbs anggrek Dendrobium yang sehat maupun plbs anggrek D.
Jayakarta yang telah bebas CyMV dengan hasil analisis bobot molekul protein CyMV berukuran sekitar 28 kDa.
ABSTRACT
Cymbidium mosaic virus (CyMV) is the one of the dominant pathogen infecting orchid plant in the world.
Detection of CyMV infection can be performed by DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assa.
To further confirm, it can be distinguished the pattern of CyMV protein bands by using composite gel electrophoresis method.
The aims of this study to distinguish the CyMV protein banding pattern by using composite gel electrophoresis method.
The results of this study showed that CyMV protein banding pattern analysis by composite gel electrophoresis method an be used to distinguish the patterns of protein bands of healthy Dendrobium plants or CyMV free - D.
Jayakarta plbs and the infected ones with molecular weight approximately 28 kDa.
Keyword: Cymbidium mosaic virus.
Dendrobium.
Composite Gel Electrophoresis *Dosen Fakultas Pertanian UNSUR
PENDAHULUAN
Tanaman hias ataupun tanaman diperbanyak secara vegetatif jika terserang virus akan menyebabkan (Pearson&Cole Anggrek merupakan komoditas hortikultura yang banyak diminati masyarakat karena memiliki variasi warna dan bentuk bunga yang indah dan relatif tahan lama dibandingkan tanaman hias yang lain.
Pada saat ini anggrek yang dominan diminati masyarakat adalah jenis Dendrobium .
%).
Oncidium Golden Shower .
%).
Cattleya .
%) dan Vanda .
%) serta anggrek lainnya .
%) (BPTP 2.
Cymbidium mosaic virus (CyMV) Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
menginfeksi tanaman anggrek.
Hasil penelitian Tanaka et al.
menunjukan bahwa beberapa kultivar anggrek banyak terinfeksi Cymbidium mosaic virus (CyMV) yaitu pada anggrek Denrobium .
7%).
Cattleya .
5%),
Oncidium .
%).
Phalaenopsis .
%) dan Vanda .
%).
Deteksi dan identifikasi secara serologi sudah umum diaplikasikan untuk berbagai virus.
Salah satu uji serologi adalah Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yang pertama kali dikembangkan oleh Clark dan Adam .
Metode ini berdasarkan pada reaksi antara antigen Diagnosis CyMV yang dilakukan oleh Miin .
Hu el al.
Navalinskiene et al .
dan Sherpa et .
dengan menggunakan metode serologi yaitu Double Antibody Sandwich (DAS) ELISA pada tanaman anggrek jenis Arachnis.
Aranda.
Asocentrum.
Cattleya.
Cymbidium.
Dendrobium.
Laelia.
Oncidium.
Paphiopedium.
Phalaenopsis.
Renanthera dan Vanda berhasil dengan baik.
Metode serologi ini menggunakan antiserum monoklonal yang bereaksi secara spesifik dengan protein selubung CyMV (Navalinskiene et al Selain dengan menggunakan identifikasi virus tanaman dapat juga dilakukan melalui teknik molekuler misalnya dengan reverse transcriptasepolimerase chain reaction (RT-PCR) (Sherpa et al.
Hsu et al.
melakukan deteksi CyMV pada anggrek dengan metode Immunosorbent Electron Microscopy (ISEM).
Metode ini diketahui lebih sensitif dibandingkan dengan metode ELISA.
Namun demikian, metode ISEM memerlukan biaya dan peralatan yang lebih mahal dibandingkan dengan metode DASELISA.
Untuk lebih memastikan lagi bahwa virus yang menginfeksi tanaman anggrek tersebut adalah CyMV, maka dapat dilakukan pembedaan pola pita Elektroforesis Gel Komposit.
Metode ini tidak termasuk metode modern seperti RT-PCR dan ISEM.
Akan tetapi metode ini dapat digunakan dapat digunakan untuk menganalisis virus tanaman dengan melakukan perlakuan yang berbeda terhadap gel sebagai media pemisahan proteinnya.
Metoda ini dilakukan Wolf dan Casper .
untuk memisahkan Tobacco mosaic virus (TMV) dan Turniv yellow mosaic virus (TYMV), yang juga diketahui bahwa kedua virus ini dapat menginfeksi tanaman anggrek.
Dari hasil elektroforesis ini dapat dilihat perbedaan pola pita proteinnya, serta dapat ditentukan juga bobot molekul (BM) dari CyMV tersebut.
Penelitian membedakan pola pita protein tanaman anggrek Dendrobium yang sehat dan protocorm like bodies .
bebas CyMV dengan tanaman dan plbs .
erinfeksi CyMV) menggunakan metode elektroforesis gel komposit.
TINJAUAN PUSTAKA
Cymbidium mosaic virus (CyMV) Tanaman anggrek yang baik adalah tanaman anggrek yang sehat Ae lingkungan seperti media tumbuh, cahaya matahari, suhu, kelembaban udara dan faktor infeksi patogen.
Patogen yang sering menimbulkan kerugian pada anggrek adalah virus.
Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
Beberapa virus yang dapat menginfeksi tanaman anggrek diantaranya :
Cymbidium CyMV.
Odontoglossum ringspot virus (ORSV).
Cymbidium ringspot virus (CRSV).
Cucumber mosaic virus (CMV).
Orchid fleck virus (OFV) (Kondo et al.
Diketahui CyMV merupakan virus yang paling banyak menimbulkan kerugian secara ekonomi pada tanaman Penyakit tanaman anggrek yang disebabkan CyMV pertama kali diidentifikasi pada tahun 1950 oleh Jensen di California (ICTVdB 2.
Secara etiologi agen diidentifikasi sebagai virus yang dinamai CyMV.
Sejak CyMV keberadaannya di beberapa Negara penghasil bunga potong di Eropa.
Aurstralia.
Amerika.
Afrika dan Asia.
CyMV merupakan virus yang termasuk family Flexiviridae dan genus Potexvirus.
Gejala yang ditimbulkan oleh CyMV terjadinya nekrosis .
intik-bintik, garisgaris atau lingkaran-lingkara.
pada Virus tersebut umum ditemukan pada tanaman anggrek yang dibudidayakan, hal ini disebabkan virus tersebut dapat ditularkan melalui alatalat pertanian, seperti gunting dan pot yang terkontaminasi dan tidak ditularkan oleh serangga ataupun biji (Wisler 1.
Studi virion-virion CyMV berbentuk filamentous dengan diameter 480 x 13 nm yang tidak mempunyai titik inaktivasi 60-70 oC selama 10 menit serta dapat bertahan pada cairan perasan tanaman selama 25 hari pada suhu ruang dalam kondisi in Genom CyMV merupakan ssRNA linear dan berukuran 8,1 kb.
Genom CyMV pertama kali diisolasi oleh Frowd dan Tremaine .
dan mempunyai komposisi basa G 21.
A 28.
C24,4% dan U 25,6%.
Deteksi CyMV dengan Enzyme
Linked Immunosorbent Assay
(ELISA)
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assa.
adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi spesifik mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator.
Prinsip dasar ELISA (Burgess 1.
adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen yang dilabel enzim.
Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna.
Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi pada ELISA plate reader.
Jenis teknik ELISA yang banyak digunakan adalah Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA).
Prinsip pengujian virus dengan teknik ini adalah antibodi .
virus yang spesifik teradsorpsi pada permukaan lubang Aupolystyrene microtiter plateAy.
Antibodi tersebut akan menangkap antigen .
irus yang terdapat pada sampe.
Selanjutnya virus tersebut akan bereaksi dengan spesifik antibodi yang telah dilabel dengan alkalin fosfatase.
Ada tidaknya virus dalam sampel ditandai dengan berubahnya warna menjadi kuning setelah diberi penyangga substrat yang 4-nitrofenilfosfat.
Perubahan warna terjadi karena 4nitrofenil dirubah menjadi 4-nitrofenol yang intensitas warna kuningnya Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
sebanding dengan banyaknya antigen yang tertangkap oleh antibodi (Clark & Adam 1977.
BALITHI 2.
IgG AP-CyMV IgG-CyMV 4-Nitrofenilposfat CyMV Gambar 1 Prinsip dasar DAS - ELISA Elektroforesis Gel Komposit Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan senyawa berdasarkan kecepatan migrasi dari senyawa yang bermuatan listrik di bawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama merupakan metoda standar untuk pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA.
Prinsip dasar teknik ini adalah DNA.
RNA atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik, dalam hal ini molekul-molekul tersebut perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel (Suryani dan Ambarsari 2.
Gel yang biasa digunakan merupakan gel poliakrilamid untuk pemisahan protein atau asam nukleat berukuran kecil, sedangkan gel agarosa digunakan untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar .
ebih besar dari beberapa ratus bas.
(Suryani dan Ambarsari 2.
Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
Gambar 2 Prinsip dasar Elektroforesis Elektroforesis gel poliakrilamid dapat digunakan untuk meneliti protein virus (Wolf dan Casper 1971.
Khalimi 2.
, akan tetapi jarang digunakan untuk memisahkan seluruh virus.
Tiselius, et al.
pertama kali memisahkan virus tanaman Turniv yellow misaic virus (TYMV) dengan Semancik .
menggunakan metode mengkarakterisasi komponen virus tanaman yang dimurnikan, akan tetapi poliakrilamid tidak memungkinkan untuk virus dengan partikel seperti Tobacco mosaic virus (TMV) atau Tobacco rattle virus.
Wolf dan Casper .
telah melakukan penelitian tentang elektroforesis untuk virus dengan menggunakan gel akrilamid-agaros Hasil
menunjukan bahwa Turniv yellow mosaic
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga Mei 2011.
Tempat Laboratorium Virologi.
Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung Ae Cianjur.
Bahan dan Alat Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman anggrek Dendrobium dan plbs .
rotocorm likes bodie.
anggrek Dendrobium Jayakarta yang sudah diketahui bebas CyMV hasil perlakuan zat antiviral Ribavirin 30 ppm (Syamsiah 2.
, plbs anggrek D.
Jayakarta dan tanaman virus (TYMV) dan Tobacco mosaic virus (TMV) dapat dipisahkan satu sama lain dan dari protein tanaman dengan jelas menggunakan metode elektroforesis akrilamid-agaros.
Metode ini telah memisahkan asam nukleat dan ribosom (Peacock dan Dingman 1968, 1.
serta untuk menganalisis bean yellow mosaic virus (Makkock, et al.
Prosedur yang digunakan dalam Elektroforesis Gel Komposit atau campuran akrilamid dan agaros ini elektroforesis pada umumnya yaitu terdiri atas preparasi sampel, preparasi gel, running, visualisasi dan penentuan ukuran molekul.
Metode Elektroforesis Gel Komposit yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada metode yang dilakukan Wolf dan Casper .
dengan komposisi campuran gel akrilamid 2% dan agaros 0,5%.
anggrek Dendrobium yang positif CyMV, akrilamid, agarosa.
TEMED (Tetra Metil Etilen Diami.
APS (Amonium persulfa.
Amidoblack.
Asam asetat.
Penanda protein atau Marker (Protein Molecular Weight Marke.
produk Fermentas .
mengandung : -galactosidase .
Bovine serum albumin .
2 kD.
Ovalbumin .
Lactate dehydrogenase .
REase Bsp 981 .
Lactoglobulin .
4 kD.
Lysozyme .
Sedangkan alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Beaker glass, gelas ukur, water bath, termometer, microwave, perangkat elektroforesis dan alat lainnya sebagai penunjang.
Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
Metode Penelitian Pembuatan gel: Campuran agaros dan aquades dalam wadah I dipanaskan dalam microwave, sementara itu campuran acrylamid:bis dan TBE 3x dalam wadah II dipanaskan dalam inkubator .
ater bat.
100oC selama 20 Lalu ditambahkan 200 AAl APS 10% ke wadah I dan 30 AAl TEMED ke wadah II.
Setelah hangat kuku, dicampurkan kedua larutan tersebut, diaduk sebentar, kemudian dicetak dalam casting .
encetak ge.
Prosedur : 1 g daun/plbs digerus dalam 1 ml buffer ekstraksi menggunakan mortar lalu diinkubasi 10 menit pada suhu 50 oC .
ater bat.
Selanjutnya disentrifus 12.
000 rpm Supernatan Sebelum dipakai disimpan di suhu 4 100 AAl supernatan tiap sampel yang sudah dicampur dengan 20 AAl loading buffer serta Marker dipanaskan pada suhu 95oC selama 5 menit lalu didinginkan selama 15 detik dan dimasukan ke dalam sumur gel.
Running dilakukan selama A 3,5 jam pada voltase 50 volt.
Untuk visualisasi dilakukan menggunakan pewarnaan dengan Amidoblack .
,1 g amidoblack dalam 100 ml 7% asam aseta.
Kemudian ditentukan nilai Bobot molekul (BM) CyMV sesuai Marker yang digunakan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil analisis pita protein CyMV pada anggrek Dendrobium Jayakarta dengan metoda Elektroforesis Gel Komposit menunjukkan adanya pita yang jelas untuk tanaman anggrek Dendrobium dan plbs anggrek D.
Jayakarta yang sakit atau terinfeksi CyMV.
Pita tersebut menunjukan adanya kandungan CyMV pada sampel Tanaman dan plbs yang positif terinfeksi CyMV (Gambar .
Tebal tipisnya pita yang terbentuk berhubungan erat dengan kandungan virusnya.
Hal ini dapat dilihat dari hasil elektroforesis, pita pada lajur no.
1 yang berasal dari sampel tanaman anggrek Dendrobium positif terinfeksi CyMV lebih jelas dibandingkan pita pada lajur no.
3 yang berasal dari plbs anggrek D.
Jayakarta positif terinfeksi CyMV.
Sedangkan untuk tanaman anggrek yang sehat atau tidak terinfeksi CyMV dan plbs hasil perlakuan zat antiviral Ribavirin 30 ppm menunjukkan tidak terbentuknya pita protein virus, hal ini berarti tanaman tersebut benar benar tidak terinfeksi CyMV dan plbs hasil perlakuan zat antiviral Ribavirin 30 ppm tersebut terbukti sudah terbebas dari CyMV.
Hasil ini sesuai dengan eliminasi CyMV pada konsentrasi Ribavirin 30 ppm dengan uji DASELISA menunjukkan persen bebas sebesar 100%.
Hasil elektroforesis ini dapat dilihat pada Gambar 3.
Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
45 kDa 14,4 kDa Gambar 3 Hasil analisis pita protein CyMV dengan Elektroforesis Gel Komposit M = Marker.
Tanaman anggrek Dendrobium positif terinfeksi CyMV.
Tanaman anggrek Dendrobium negatif terinfeksi CyMV.
Plbs anggrek D.
Jayakarta positif terinfeksi CyMVdan .
Plbs anggrek D.
Jayakarta negatif/ bebas CyMV .
asil perlakuan zat antiviral Ribavirin 30 pp.
Hasil analisis bobot molekul (BM) dari data yang diperoleh pada Elektroforesis Gel Komposit menunjukkan bahwa bobot molekul protein CyMV pada tanaman anggrek Dendrobium positif terinfeksi CyMV adalah sekitar 28.
85 kDa, sedangkan pada plbs anggrek D.
Jayakarta positif terinfeksi CyMV yang dipakai untuk perlakuan antiviral Ribavirin adalah 82 kDa (Tabel .
Bobot diperoleh dari hasil estimasi kurva Log BM Marker dengan Rm (Relative mobilit.
(Anderson et al 1974.
Plikaytis et al 1.
dimana nilai Rm diperoleh dari hasil bagi jarak pergerakan protein dari tempat awal dengan jarak pergerakan warna dari tempat awal (Boyer 2.
Hasil analisis BM CyMV dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2 serta kurva estimasinya pada Gambar 4.
Berdasarkan hasil elektroforesis diketahui pada kolom Marker terdapat lima pita potein yang tampak.
Kelima pita Marker yang tampak memiliki bobot molekul 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18.
4 kDa dan 14.
4 kDa (Tabel .
Nilai bobot molekul Marker yang dipakai berasal dari protein Ovalbumin (Chicken egg whit.
Lactate dehydrogenase .
orcine muscl.
REase Bsp981 (E.
Col.
, - Lactoglobulin (Bovine mil.
Lysozyme (Chicken egg whit.
(Fermentas 2004.
Tabel 1 Nilai Rm .
dan Log BM Marker hasil elektroforesis BM Marker Log BM Jarak Pita pada Gel .
Panjang gel .
Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
Sumber: Data primer .
, 2011 Hasil Elektroforesis Gel Komposit menunjukan bahwa bobot molekul CyMV Dendrobium dan plbs anggrek D.
Jayakarta yang positif terinfeksi CyMV diestimasi sekitar 28 kDa (Tabel .
Hasil ini dapat diartikan bahwa pita protein yang tampak diduga sebagai bobot molekul protein Cymbidium mosaic virus.
Berdasarkan International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), termasuk CyMV dilihat dari bobot Hasil ini bersesuaian dengan penelitian Moreira, et al.
yang melaporkan bahwa bobot molekul CyMV yang menginfeksi tanaman anggrek Phaius tankerville diestimasi sekitar 28 kDa dengan metoda SDS-PAGE.
Log BM Gambar 4 Kurva estimasi Rm dengan Log BM Marker Begitu pula dengan yang dilaporkan Khalimi .
dimana CyMV menginfeksi daun tanaman N.
benthamiana dengan metoda SDSPAGE juga menunjukan hasil sekitar 28 kDa.
Sedangkan hasil penelitian yang lain, seperti yang dilaporkan Miin .
dan Han et al.
bahwa CyMV menginfeksi tanaman anggrek di Malaysia dan Korea diestimasi sekitar 64 kDa.
Tabel 2 Hasil analisis pita protein positif terinfeksi CyMV pada sampel tanaman dan plbs anggrek Dendrobium Sampel Jarak pita pada gel .
Panjang gel .
Log BM Tanaman anggrek ( ) terinfeksi CyMV Analisis Pola Pita Protein Cymbidium mosaic virus pada protocorm likes bodies Anggrek Dendrobium Jayakarta dan Tanaman Anggrek Dendrobium Menggunakan Metode Elektroforesis Gel Komposit.
Melissa Syamsiah.
Plbs anggrek ( ) terinfeksi CyMV Sumber: Data primer .
, 2011
SIMPULAN
Analisis pita protein CyMV pada tanaman anggrek Dendrobium dan plbs anggrek D.
Jayakarta dapat dilakukan Elektroforesis Gel Komposit.
Tanaman anggrek Dendrobium dan plbs anggrek D.
Jayakarta yang sakit atau positif terinfeksi CyMV memiliki pita protein dengan ukuran BM sekitar 28 kDa.
Tanaman anggrek Dendrobium yang sehat maupun plbs anggrek D.
Jayakarta yang telah bebas CyMV hasil perlakuan zat antiviral Ribavirin 30 ppm tidak memiliki pita protein dengan ukuran BM sekitar 28 kDa.
Boyer R.
Modern Experimental Biochemistry.
San Fransisco: Adison Wesley Longman Inc.
SARAN
Analisis protein Cymbidium mosaic virus pada tanaman anggrek Dendrobium maupun protocorm likes bodies anggrek Dendrobium Jayakarta dapat dilakukan Elektroforesis Gel Komposit.
Clark MF and Adam AN.
Characteristics of the Microplate of enzyme linked imunosorbent assay for the detection of plant viruses.
Gen.
Virol 34: 475 Ae 483.
DAFTAR PUSTAKA