p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019
ISOLASI GEN smtAB BAKTERI RESISTEN LOGAM BERAT Pb
DARI LIMBAH CAIR AGAR
Generation Insulation smtAB Resistent Bacteria Pb Heavy Metal In Liquid Waste Senja Ike Rismawati1 Prodi Teknologi Hasil Perikanan Universitas Yudharta Pasuruan Email: senjaiker@gmail.
ABSTRAK
Bakteri Indigen adalah bakteri asli yang memiliki kemampuan untuk mereduksi senyawa berbahaya termasuk logam berat Pb.
Bakteri indigen yang diisolasi dari limbah cair tepung agar diketehui memiliki kemampuan mereduksi logam berat Pb adalah Bacillus alvei.
Bacillus pumilus dan Bacillus lichenformis.
Kemampuan bakteri dalam mereduksi logam berat Pb disebabkan karena adanya gen resisten, yaitu gen smtAB.
Gen smtAB merupakan gen yang bekerja untuk menghasilkan protein pengikat logam berat yang disebut metallothionein.
Setiap bakteri memiliki gen resisten logam berat yang berbeda, oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesies bakteri yang memiliki gen smtAB pada bakteri yang diisolasi dari limbah cair agar.
Jenis penelitian yang dilakukan adalah deskriptif kualitatif.
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu peremajaan isolat bakteri, kultur isolat bakteri, isolasi DNA dengan PrestoE Mini gDNA Bacteria Kit.
Elektoforesis, amplifikasi gen smtAB dan konfirmasi sekuens dengan hasil sekuensing amplikon.
Berdasarkan hasil amplifikasi, bakteri indigen limbah cair agar yang memiliki gen smtAB adalah bacillus alvei.
Isolasi gen smtAB yang diakukan menghasilkan sekuen yang tidak spesifik dengan gen target.
Kata Kunci: Isolasi Gen smtAB.
Bakteri Resisten Logam Berat Pb.
Limbah Cair Agar ABSTRACT Indigenic bacteria are native bacteria that have the ability to reduce harmful compounds including Pb heavy metals.
Indigenic bacteria isolated from flour liquid waste to be known to have the ability to reduce Pb heavy metals are Bacillus alvei.
Bacillus pumilus and Bacillus lichenformis.
The ability of bacteria to reduce Pb heavy metal is caused by the presence of resistant genes, namely the smtAB gene.
The smtAB gene is a gene that works to produce heavy metal binding proteins called Each bacterium has a different heavy metal resistant gene, therefore this study aims to determine the bacterial species that have a common gene in bacteria isolated from agar liquid waste.
The type of research conducted is qualitative This study consisted of several stages, namely rejuvenation of bacterial isolates, bacterial isolate culture.
DNA isolation with Presto E Mini gDNA Bacteria Kit.
Electrophoresis.
SMAB gene amplification and sequence confirmation with amplicon sequencing results.
Based on the results of amplification, the liquid waste indigen bacteria so that the smtAB gene is bacillus alvei.
The isolation of the SMT gene that was carried out produced a sequence that was not specific to the target gene.
Keywords: smtAB Gen Insulation.
Pb Heavy Metal Resistant Bacteria.
Agar Waste p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019
PENDAHULUAN
al, 2.
Untuk mengurangi efek negatif Pembangunan di bidang industri yang timbulkan oleh logam berat maka tidak jarang menimbulkan dampak negatif berupa limbah yang dihasilkan baik remediasi atau bioremediasi.
Bioremediasi Meningkatnya industrialisasi akan menyebabkan pula (Khasanah, berbahaya ke lingkungan merupakan teknik untuk yang berasal (Soleimani dan Jaberi, 2.
seperti dari limbah industri, terutama limbah yang jamur, ragi, dan bakteri (Chatterjee et al.
mengandung logam berat (Gerdhart et al.
Terdapat banyak jenis bakteri yang Kontaminasi oleh logam berat menjadi perhatian serius karena dapat satunya adalah bakteri indigen yang mencemari tanah maupun air tanah serta diisolasi dari limbah cair agar PT X.
dapat menyebar ke daerah sekitarnya Isolat Bakteri indigen yang telah berhasil melalui air, angin dan dapat terakumulasi diisolasi dari limbah cair agar adalah oleh tumbuhan (Knox et al.
, 2.
Bacillus alvei.
Bacillus pumilus dan Logam berat juga tidak dapat didegradasi Bacillus lichenformis oleh tubuh dan bersifat racun pada mahluk Bakteri mampu bertahan hidup di hidup serta dapat terakumulasi dalam lingkungan yang terkontaminasi logam jangka waktu tertentu (Buhani, 2.
karena mempunyai gen resisten.
Logam berat timbal (P.
dapat Salah satu gen resisten adalah gen smtAB menyebabkan gangguan pada sistem saraf, yang terlibat dalam produksi protein .
yang dapat mengikat logam berat (Shimoda et al.
, 2.
(Suhendrayatna, 2.
Pemaparan jangka Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui panjang logam berat timbal (P.
pada spesies bakteri indigen dari limbah cair
manusia dapat menyebabkan anemia, agar PT X yang memiliki gen smtAB
kanker, mengganggu metabolisme vitamin
METODE
D dan dapat kematian jika dalam darah Penelitian ini dilakukan di laboratorium manusia mengandung 70AAg/dl (Fonte et mikrobiologi Universitas Negeri Malang al, 2007.
Lam et al, 2007 dan Steenland et dan laboratorium Genetika dan Biologi p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 Molekuler Departemen Biologi Fakultas secara aseptik dan digoreskan pada media Sains dan Teknologi Universitas Islam miring, kemudian isolat diinkubasi pada Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.
suhu 37AC.
Peralatan yang digunakan antara lain Persiapan Kultur Bakteri Isolat bakteri Bacillus alvei.
Bacillus eppendorf.
Laminar Air Flow, sentrifugasi, mikropipet, mikrotip, frezeer, dalam medium cair LB dan vortex, mesin sentrifugasi.
GD column, ditumbuhkan selama 24 jam pada 37oC collection tube, inkubator, kertas parafilm, diaduk pada kecepatan 150-175 rpm UV box, seperangkat alat elektroforesis dalam water bath shaker.
Setelah 24 jam merek BioRad, transiluminator mesin UV pertumbuhan sel Setelah itu isolat bakteri .
el Doc ) seri molekul BioRad gel Doc siap untuk diisolasi DNAnya TM Image Xr sistem pencitraan dan Isolasi Genom DNA perangkat lunak Quantity One.
Isolasi genom DNA bakteri Bacillus alvei.
Bahan yang diperlukan antara lain isolat Bacillus bakteri indigen limbah cair agar yaitu lichenformis dilakukan menggunakan kit Bacillus alvei.
Bacillus pumilus dan isolasi DNA yaitu Presto mini gDNA Bacillus lichenformis, ddH2O, proteinase Bacteria Kit.
Tahapan isolasi DNA bakteri K, buffer TE, bahan dari PrestoE Mini adalah sebagai berikut:
gDNA Bacteria Kit, dan gel agarose 1%.
Persiapan Bacillus Bacillus Pindahkan agarosa gel.
TBE (Tris Boric EDTA), bakteri .
inimal 1x.
pada tube EtBr 5 ml.
Sentrifugasi pewarna, air deionisasi.
Master Mix PCR selama 1 menit pada 14 - 16.
000 rpm merek Promega (Taq polimerase, dNTPs, kemudian buang supernatan.
Tuang buffer PCR), primer smt1 .
Ao GAT CGA buffer Gram .
AAl/sampe.
pada CGT TGC AGA GAC AG 3A.
dan smt2 tube sentrifugasi .
Ao GAT CGA g CGT t GAT AA Lysozyme .
mg/m.
pada buffer gram 3A.
, marker.
DNA terisolasi .
, .
alam tube sentrifugasi 15 m.
aquabidest, air suling, dan es batu.
kemudian vortex untuk melarutkan Peremajaan Bakteri Lysozyme secara keseluruhan.
Tuang Peremajaan bakteri dilakukan dengan 200 AAl buffer Gram .
ang telah mengambil isolat bakteri sebanyak 1 ose ditambah Lysozym.
pada sampel di (Ethidium 15 ml.
Tambah p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 kemudian resuspensi Pencucian: Tambahkan 400 AAl buffer pelet dengan W1 pada kolom GD.
Sentrifugasi pada vortex atau pipet.
Inkubasi pada 37 C 14 Ae 16.
000 selama 30 detik kemudian selama 30 menit.
Selama inkubasi, buat cairan.
Tempatkan kembali kolom balik-balik GD pada tube koleksi 2 ml.
Tambah Tambahkan 20 AAl Pro K .
ang telah 600 AAl wash buffer .
elah ditambah ditambah ddH2O).
Inkubasi pada 600C etano.
pada kolom GD.
Sentrifugasi minimal 10 menit.
Selama inkubasi, pada 14 Ae 16.
000 selama 30 detik lalu balik-balik tube setiap 3 menit.
Tempatkan Lisis: Tambahkan 200 AAl buffer GB kolom GD pada tube koleksi 2 ml.
pada sampel dan campur dengan vortex Sentrifugasi lagi selama 3 menit pada selama 10 detik.
Inkubasi pada 700C 14 Ae 16.
000 untuk mengeringkan minimal 10 menit untuk memastikan matriks kolom.
lysate sampel telah hilang.
Selama Elusi Volume elusi standar adalah 100 inkubasi, balik-balik tube setiap 3 AAl.
Jika sampel yang digunakan kurang.
Saat ini, panaskan terlebih dulu kurangi volume elusi .
-50 AA.
untuk buffer elusi yang diperlukan .
AAl meningkatkan konsentrasi DNA.
Jika per sampe.
pada 700C .
ntuk tahap 5 menginginkan hasil DNA lebih tinggi.
DNA Elus.
ulangi tahap elusi untuk meningkatkan Pengikatan DNA: Tambahkan 200 AAl perolehan DNA dan volume total elusi etanol absolut pada sampel dan campur sekitar 200 AAl.
Pindahkan kolom GD segera dengan mengocok kuat-kuat.
kering pada tube microcentrifuge 1.
Jika Tambah 100 AAl buffer TE ke tengah dengan pipet.
Tempatkan kolom GD matriks kolom.
Biarkan selama 3 menit dalam tube koleksi 2 ml.
Tuang supaya buffer TE diserap sempurna.
ermasuk presipitat tidak Sentrifugasi pada 14-16.
000 selama 30 terlaru.
pada kolom GD kemudian detik untuk mengelusi DNA murni.
sentrifugasi pada 14 Ae 16.
000 selama 2 Uji Hasil Isolasi DNA Kemurnian hasil isolasi genom DNA bakteri diuji dengan menggunakan alat Lepas tempatkan kolom GD pada tube koleksi 2 ml baru.
sebai berikut:
langkah-langkahnya p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 Blank Nanodrop menggunakan 5 Analisis Hasil Sekuensing mikrolit buffer TE.
Sekuens Meneteskan 5 mikrolit sampel DNA pada Nanodrop.
Membaca grafik kemurnian dan BLAST website w.
konsentrasi DNA
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi
DNA
Bacillus alvei.
Bacillus pumilus dan Amplifikasi gen smtAB Amplifikasi gen smtAB dilakukan Bacillus lichenformis yang dilakukan dengan metode PCR dengan primer smt1 .
Ao GAT CGA CGT TGC AGA GAC AG Bacteria Kit 3A.
dan smt2 .
Ao GAT CGA g CGT Berdasarkan Pengukuran t GAT AA 3A.
, denaturasi awal pada DNA suhu 94AC selama 3 menit, denaturasi spektrofotometer Nano Drop 2000 pada pada suhu 94AC selama 1 menit, annealing panjang gelombang 260/280 nm (Tabel pada suhu 56AC selama 1 menit.
Elongasi .
isolat H memiliki rasio 260/280 nm pada suhu 72AC selama 1 menit, pasca sebesar 1,857, isolat E memiliki rasio elongasi pada suhu 72AC selama 5 menit 260/280 nm sebesar 1,883 dan isolat F dilakukan sebanyak 35 siklus.
Untuk memilik rasio 260/280 nm sebesar 1,877.
Nilai rasio 260/280 nm tiap isolat tersebut diseparasi dilakukan elektroforesis.
Proses menunjukkan bahwa ketiga isolat telah elektroforesis menggunakan elektroforesis murni tanpa kontaminan apapun.
Hal ini horizontal pada gel 1,5%.
Produk hasil didukung oleh penyataan Clark .
DNA Presto gDNA memberikan hasil yang teramplifikasi melalui PCR dikirim ke memiliki nilai rasio Optical Density (OD) perusahaan (First BASE.
Laboratories 260/280 Selangor.
Malaysi.
untuk disekuensing.
I260/yI.
Alat yang digunakan adalah ABI PRISM 3730 Genomic Analyzer.
Biosystem USA protein, sedangkan rasio lebih dari 1,9 1,8-1,9.
(Khosravinia et al.
, 2.
Rasio
RNA
p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019
Tabel 1 Kemurnian Genom DNA Bakteri Indigen Paling Potensial Sampel
Rasio 260/280 Konsentrasi AAg/g sampel
Bacillus alvei 1,857 Bacillus pumilus
1,883
Bacillus lichenformis 1,877 bahwa pola pita elektroforesis DNA kromosom bakteri dengan menggunakan marka DNA 250bpAe10000bp terpisah pada daerah diatas 10000bp.
Amplifikasi gen target pada isolat bakteri indigen H.
E dan F telah dilakukan dengan menggunakan sepasang primer smt1 .
Ao GAT CGA CGT TGC AGA GAC AG 3A.
dan smt2 .
Ao GAT CGA g CGT t GAT AA 3A.
dengan suhu denaturasi awal sebesar 94AC selama Gambar 1 Pola Elektroforesis DNA Genom Bakteri Indigen 3 menit, 1 menit denaturasi dengan suhu Keterangan: Marker = 1kb.
H= Bacillus alvei.
E= 94AC, anealling selama 1 menit dengan Bacillus pumilus dan F= Bacillus lichenformis suhu 56AC, 1 menit elongasi dengan suhu Berdasarkan visualisasi (Gambar.
72AC dan 5 menit pasca elongasi dengan hasil elektroforesis genom DNA ketiga suhu 72AC sebanyak 35 siklus.
Hanya bakteri terdeteksi adanya molekul dengan isolat bakteri indigen H yang berhasil diatas wilayah 10.
000 bp.
Ukuran pita teramplifikasi dengan panjang sekuen gen yang jelas dan tebal mengindikasikan berkisar 500bp.
Amplifikasi gen target dengan panjang 500bp adalah sesuai dengan amplikon yang diharapkan dari Tertahannya laju migrasi molekul pada sepasang primer yang telah digunakan daerah 10000 bp mengindikasikan bahwa sehingga hanya isolat bakteri indigen H molekul tersebut adalah molekul DNA yang akan disekuensing.
Hasil amplifikasi kromosom bakteri, karena berdasarkan fragmen gen smtAB disajikan dalam penelitian Demerdash .
kromosom Gambar 2 bakteri memiliki ukuran lebih dari 10000 bp, yakni 21000 bp Ae 23000 bp.
Wang dalam Nuroniyah .
juga melaporkan p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 dan F adalah perbedaan sekuen gen pada isolat bakteri E dan F dengan primer yang Yuwono .
menyebutkan bahwa pada saat proses annealing, primer akan menempel pada untaian DNA yang telah terpisah menjadi rantai tunggal.
Primer untaian DNA pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer.
Gambar 2 Amplifikasi Daerah Gen Target Berdasarkan Keterangan: Marker = 1kb.
H= Bacillus alvei.
E= PCR yang komplementer dengan perekatan primer gen pengkode menunjukkan band .
ita DNA) pada isolat H sepanjang A500 bp dikatakan, isolat bakteri E dan F tidak Bacillus pumilus dan F= Bacillus lichenformis Pengecekan Hasil analisis sekuen fragmen gen (Gambar .
sedangkan untuk isolat E dan F tidak menunjukkan amplifikasi.
Hal ini berarti panjang sekuens basa nukleotida adalah sebesar 479 bp.
Sekuens nukleotida hasil smtAB.
Salah sekuensing ditunjukkan pada Gambar 3 sedangkan pada isolat E dan F tidak sekuen gen smtAB.
pada isolat bakteri E Gambar 3 Hasil sekuensing Hasil amplifikasi yang diduga telah Biosystem USA.
Analisis mengamplifikasi gen target di baca urutan sekuensing menggunakan fasilitas Peak
basanya menggunakan alat sekuenser ABI
PRISM
sekuensing fragmen DNA menunjukkan Genomic Analyzer, .
BLAST Hasil p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 panjang sekuens basa nukleotida adalah Trace untuk memaksimalkan pembacaan sebesar 479 bp yang diperoleh tidak spesifik, terlihat dari adanya urutan basa Notasi N menunjukkan sekuens ganda yang tidak terbaca yang ditunjukkan pada bagian awal dan akhir fragmen dengan munculnya notasi N.
Sekuen DNA (Gambar .
uncak-puncak dikoreksi menggunakan aplikasi Peak Gambar 4 Bagian dari Sekuen yang Terbaca AoNAo Memiliki Peak Ganda .
nak pana.
Fragmen yang teramplifikasi tidak didapat merupakan bagian dari genom ditunjukkan dengan banyaknya notasi N.
bakteri tetapi bukan gen target yang Urutan basa nukleotida dibaca oleh alat sekuensing berdasarkan peak .
uncak grafi.
kromatogram yang mencirikan primer memegang peran penting untuk tersebut menunjukkan bahwa sekuen yang Hal ini diduga disebabkan Desain
DNA
menggunakan pembeda warna.
Sekuen teramplifikasi adalah spesifik atau tunggal (Thompson, 2.
Primer yang didesain tidak spesifik atau terlalu umum dijumpai sekuensing dapat dilakukan berdasarkan kromatogram tersebut (McGill, 2.
menyebabkan munculnya lebih dari satu Query merupakan frekuensi basa tapak perlekatan primer .
inding sid.
nukleotida yang sama dengan sekuen gen (McGill, 2.
Hasil visualisasi fragmen hasil PCR (Gambar 2.
) menunjukkan satu pita, sehingga kemungkinannya fragmen Hasil BLAST dari sekuen menunjukkan Query sebesar 80% dengan genom bakteri conserve gen target melainkan bagain dari Bacillus amyloliquenfaciens L33.
Hal Daerah p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 bagian urutan gen yang memiliki susunan adalah bacillus alvei.
isolasi gen smtAB basa yang konstan pada sekelompok menghasilkan sekuen yang tidak spesifik makluk hidup sehingga dapat dijadikan dengan gen target.
pengenal gen target (Tang et al.
, 2.
Saran untuk penelitian selanjutnya Hasil penelitian ini diketahui bahwa adalah perlu adanya penggunaan primer pendesainan primer pada daerah conserve yang lebih spesifik dan metode isolasi dari spesies yang berbeda memberikan yang berbeda dengan penelitian ini.
kemungkinan untuk terjadi amplifikasi ganda yang menyebabkan kesulitan dalam DAFTAR PUSTAKA Buhani.
Alga Sebagai Biondikator dan Biosorben Logam Berat Bagian :1Ay.
http//w.
org diakses pada 10 januari 2015 gen target.
Primer didesain sebaiknya dapat mengamplifikasi secara spesifik lokus gen target.
Referensi sekuen gen yang berasal dari kerabat yang Clark.
Molecular Biology.
USA:
Elsevier Academic Press.
tidak dekat perlu dikaji dari sudut pandang lain yaitu diantaranya posisi translasi yang Fonte.
Agosti.
Scafa.
F and Chandura.
Anemia and Abdiminal Pain Due Occupational Lead Poisoning.
Haematologica.
92: 13-14
benar (Open Reading Frame atau ORF), ekson-intron (Thomas et al.
, 2.
, serta homologi evolusioner (Thompson dan Denis, 2.
Hal lain yang harus Gerdhart.
Huang.
Bernard R.
Greenberg.
, and Bruce.
Phytoremediation of organic soil Journal Phytoremediation.
Department of Biology University of Waterloo.
Elsevier Science Limited.
Canada.
diperhatikan dalam merancang primer adalah bahwa gen yang mengkode sifat tertentu pada beberapa jenis makhluk namun bersifat spesifik baik dalam hal urutan basa nukleotida maupun urutan Khasanah.
Eliya.
Adsorpsi Logam Berat.
Oceana.
Vol xIV No 4:1-7 asam amino (Thomas et al.
, 2.
Kesimpulan dan Saran Khosravinia.
Murthy.
Prasad, & N.
Pirany.
Optimizing Factors Influencing DNA extraction.
African Journal of Biotechnology, 6.
Knox.
Seaman.
Andriano.
Pierzynski.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat dikemukakan kesimpulan sebagai beikut spesies bakteri indigen dari limbah cair agar PT X yang memiliki gen smtAB p-ISSN: 2085-241X e-ISSN: 2599-3003 Agromix Volume 10.
No 1.
Maret 2019 Chemostabilization of metals in Bioremediation of Cotaminated Soils.
New York: Marcek Dekker Inc.
hlm 811-836.
Tang.
Gao.
Zhu.
Wang.
Zhou.
Jiang.
Construction Small Intelligent Focused Mutagenic Libraries Using Well Designed Combination Degenerate Primers.
BioTechniques 149-158 Lam.
Agovino.
Niu.
And Roche.
Linkage Study of Cancer Risk Among Lead Exposed Worker in New Jersy.
Sci Total Environ.
372:455-462.
McGill.
Trubleshooting Sequencing Product.
McGill University and Genome Quebec Centre Sequencing Servise Thomas.
Anand.
Suresh.
Janarthnan.
Vincent.
Designing Specific Oligonukleotide Primers for Metallothionein Genes.
Indian Journal of Biotechnology vol.
Nuroniyah dan Putra 2012.
Identifikasi Spesies Isolat Bakteri S1 Dengan Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA.
Jurnal Teknik Pomits Vol.
No.
1, .
Thompson.
Denis.
Finding Homologous Genes With Primers Designed Using Evolutionary Models (Dissertatio.
North Caroline State University Soleimani.
Mohsen and Jaberi.
Najmeh.
Comparison of Biological Thermal Remediation Methods in Decontamination of Oil Plluted Soils.
Bioremed Biodeg.
5: 3.
Yuwono,T.
Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR).
Andi.
Yogyakarta.
231 hal.
Zulaika.
, 2012.
Bakteri Resisten Logam Berat Yang Berpotensi Sebagai Biosorben Dan Bioakumulator.
Disampaikan pada Seminar Nasional Waste Managament For Suistainable Urban Developing Teknik Lingkungan ITS, 21 Februari 2012 Shimoda.
Ryuya.
Achanzar.
William E.
Qu.
Wei.
Nagamine.
Takeaki.
And Takagi.
Hitoshi.
Metallothionein is a Potential Negative Regulator of Apoptosis.
Toxicological Science.
Vol.
73: 294-300
Suhendrayatna, 2001.
Bioremoval Logam Berat Dengan Menggunakan Microorganime (Suatu Kajian Pustak.