Proper:Jurnal Penelitian Pertanian Terapan Vol 1 (2) 2023 eISSN 2988-506X Keragaman Genetik Genotipe Porang di Sulawesi Selatan Berdasarkan Penanda Molekuler RAPD Genetic Diversity of Porang Genotypes in South Sulawesi Based on RAPD Molecular Markers Muh. Dzulkifly Ashan1*, Muh Aswad Ashan2, Agussalim3, Hidayati Nurkhasanah4 1 Program Studi Teknologi Produksi Tanaman Hortikultura, Jurusan Teknologi Produksi Pertanian, Politeknik Pertanian Negeri Pangkajene Kepulauan, Pangkajene dan kepulauan, 90655 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, IPB University, Bogor, 16680 3 Agricultural Instrument Standardization Agency, Ministry of Agriculture, Manado 95000 4 Cereal Crops Agricultural Instrument Standardization Board, Ministry of Agriculture, Maros, 90513 *Corresponden Author Email: ashankifly@gmail.com 2 ABSTRAK Keragaman genetik tanaman Porang (Amorphophallus muelleri Blume) saat ini menjadi objek kajian untuk melihat kandungan glukomanan karena tingginya peminat untuk dimanfaatkan sebagai zat tambahan yang mampu mengentalkan unsur cair dalam bahan makanan. Beberapa kawasan agroforestri di Sulawesi Selatan diketahui memiliki berbagai jenis spesies porang dengan kandungan glukomanan yang berbeda. Diketahui bahwa daerah sebaran porang terdapat di tiga Kabupaten yaitu Kabupaten Maros, Kabupaten Bulukumba dan Kabupaten Bantaeng. Penelitian ini merujuk pengambilan sampel ketiga lokasi tersebut dan dilakukan analsis laboratorium di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, Jawa Barat. Penelitian berlangsung pada Bulan April sampai Juni 2023. Metode pengujian digunakan berbasis genetik dengan pengujian DNA secara kuantitatif dan kualitatif, dianalisis secara Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) dengan metode Sequential, Agglomerative, Hierarchical, and Nested Clustering (SAHN). Ukuran derajat jarak kemiripan genetik tanaman porang ditetapkan berdasarkan koefisien kemiripan (similarity coefficient) dengan menggunakan metode Group Average Clustering. Hasil data ditampilkan pohon filogenetik yang membentuk empat kelompok berdasarkan 10 penanda molekuler RAPD berdasarkan nilai koefisien kemiripannya adalah 0,61. Berdasarkan hal tersebut diperoleh hubungan kekerabatan tanaman porang terdekat adalah MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, dan BL9, kemudian BL8, dan BT8. Selanjutnya penelitian ini penting dilanjutkan untuk mendapatkan karakter morfologi dan fisiologi tanaman porang di tiga kabupaten ini. Keyword : Porang, penanda, molekuler, RAPD, keragaman. ABSTRACT The genetic diversity of the Porang plant (Amorphophallus muelleri Blume) is currently the object of study to see the glucomannan content due to the high demand to be used as an additive that can thicken liquid elements in food ingredients. Some agroforestry areas in South Sulawesi are known to have various types of porang species with different glucomannan content. It is known that porang distribution areas are found in three districts, namely Maros Regency, Bulukumba Regency and Bantaeng Regency. This study refers to the sampling of the three locations and laboratory analysis at the Molecular Biology Laboratory of the Center for Research and Development of Biotechnology and Agricultural Genetic Resources, Bogor, West Java. The research took place from April to June 2023. The test method used was genetic-based with quantitative and qualitative DNA testing, analyzed by the Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) with the Sequential, Agglomerative, Hierarchical, and Nested Clustering (SAHN) method. A measure of the degree of genetic similarity distance of porang plants is determined based on the similarity coefficient using the Group Average Clustering method. The data results show a phylogenetic tree that forms five clusters based on 10 RAPD molecular markers based on the similarity coefficient value is 0.61. Based on the result, the closest porang plant relationship is MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, and BL9, then BL8, and BT8. Furthermore, it’s important to continue this research to obtain morphological and physiological characters of porang plants in these three districts Keyword : Porang, Marker, Molecular, RAPD, Diversity 90 Keragaman Genetik Genotipe Porang berdasarkan penanda RAPD PENDAHULUAN Porang merupakan satu dari 170 jenis jenis Amorphallus yang ada di Indonesia dan di kenal di dunia. Porang jenis ini merupakan tanaman sumber karbohidrat alternatif yang mengandung glukomanan tertinggi diantara jenis Amorhophallus lainnya di Indonesia (Nikmah et al., 2016). Porang pertama kali tercatat di Kepulauan Andaman di India. Kemudian tersebar ke timur melalui Myanmar dan ke Thailand menuju Indonesia (Sari dan Suhartati, 2015). Di Indonesia, Porang tumbuh liar dan dibudidayakan di Sumatera, Madura, Bali, Nusa Tenggara Barat (NTB), Sulawesi dan sebagian besar tersebar di Jawa (Rofik et al., 2017). Adapun persebaran Porang di wilayah Jawa Timur meliputi Kabupaten Nganjuk, Madiun, dan Bojonegoro di sepanjang kawasan agroforestri (Aisah et al., 2017). Namun hasil identifikasi agroforestri menunjukkan hutan di negara berkembang belum dimanfaatkan secara optimal termasuk tanaman Porang yang tumbuh liar di hutan (Rahayuningsih, 2020). Porang (Amorphophallus muelleri Blume) merupakan tanaman liar di hutan, namun karena tingginya permintaan umbi tanaman Porang karena sangat popular terutama di Jepang, maka tanaman ini banyak dibudidayakan (Hidayah et al., 2018). Produksi umbi porang di Indonesia Tahun 2020 mencapai 142.000 ton, dan 89,65% diolah menjadi chip porang untuk ekspor. Sampai saat ini Porang telah diekspor dalam bentuk yang telah dikeringkan. Umbi Porang banyak mengandung glukomanan yang digunakan pada makanan tradisional di Asia misalnya mie, tofu, dan jelly (Setyono et al., 2021). Kadar glukomanan tertinggi di daerah Sulawesi Selatan berada di Kabupaten Sinjai dengan kadar 24,13%. Selanjutnya disusul kabupaten Gowa yaitu 19.5128%, Kabupaten Bulukumba yaitu 18.7902% dan Kabupaten Maros yaitu 18.0169%. Kadar glukomanan dengan nilai tersebut masih rendah dan belum mencapai mutu Standar Nasional Indonesia yaitu lebih dari 25% kadar glukomanan dalam umbi porang (Masniawati et al., 2023). Amorphophallus muelleri Blume adalah spesies unggulan dari keluarga Amorphophallus, tergolong sama dengan subspesies Amorphophallus bulbifer dan Amorphophallus yuloensis. Diantara ketiga spesies tersebut, hanya Amorphophallus muelleri Blume yang memiliki jumlah kromosom 2n = 26, yang dapat dihibridisasi dengan Amorphophallus konjac dan Amorphophallus albus. Amorphophallus muelleri Blume memiliki ketahanan penyakit, cenderung toleransi suhu tinggi, dan kandungan Konjac Glucomannan (KGM) tinggi. Oleh karena itu, Amorphophallus muelleri Blume merupakan sumber plasma nutfah yang penting untuk perbaikan genetik Amorphophallus konjac dan Amorphophallus albus (Zhao et al., 2020). Plasma nutfah Porang memiliki keragaman genetik yang tinggi, tentu berpotensi untuk pengembangan dan peningkatan manfaat tanaman Porang melalui program pemuliaan tanaman. Salah satu potensinya dapat dianalisis hubungan kekerabatan berdasarkan penanda molekuler. Hubungan kekerabatan plasma nutfah sangat penting bagi para pemulia karena dapat menjadi dasar perakitan individu baru yang memiliki karakter unggul melalui proses hibridisasi dimasa yang akan datang (Saleh et al., 2015). Hubungan kekerabatan dapat diidentifikasi secara singkat berdasarkan ukuran gen dalam suatu lokus/kromosom, dengan asumsi bahwa karakter yang berbeda disebabkan oleh adanya perbedaan susunan genetik (Mollah et al., 2022). Secara morfologi, penanda telah digunakan secara luas, tetapi umumnya dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga sulit untuk mengamati perbedaan antara spesies yang berkerabat dekat. Oleh karena itu, penanda molekuler berbasis RAPD menjadi alternatif dalam memecahkan permasalahan karakterisasi genotipe Porang (Nikmah et al., 2016). Penanda molekuler RAPD digunakan dikarenakan tanaman Porang masih pada tahap awal karakterisasi ataupun klasifikasi akibat belum tersedianya pangkalan pusat data tanaman Porang (Primer spesifik), metode ini tidak memerlukan pengetahuan tentang latar belakang genom yang dianalisis, dan 91 Ashan et al. primer yang diperlukan sudah banyak dikomersialisasikan sehingga mudah diperoleh (Novita et al., 2014). Hasil penelitian dengan penanda RAPD digunakan pada variasi delapan varian pigmen warna pada tumbuhan misalnya kadar klorofil, β-karoten dan senyawa antosianin. hasil amplifikasi RAPD menggunakan primer OPA-11, OPC-04, OPU-06, OPC-07 dan OPN-18E menghasilkan pita polimorfik secara berturut-turut yakni 13 pita (250-1000 bp), 14 pita (250-2500 bp), 17 pita (250-2500 bp), 8 pita (250-1500 bp), dan 7 pita (250-1500 bp). Jumlah pita polimorfik tertinggi (17 pita) terdapat pada primer OPU-06, sedangkan jumlah terendah (7 pita) terdapat pada primer OPN-18E. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak terdapat kelompok yang memiliki hubungan kekerabatan berdasarkan variasi glukomanan (Porang Research Center, 2023). Penelitian tersebut berkenaan pula dengan kegiatan pengelompokkan berdasarkan kedekatannya dengan penanda genetik. Berdasarkan uraian permasalahan diatas, maka perlu dilakukan Karakterisasi Genotipe Porang Sulawesi Selatan berdasarkan Penanda Molekuler RAPD sehingga hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan untuk mengkarakterisasi dan mengelompokkan jenis-jenis porang pada beberapa wilayah ke dalam satu grup berdasarkan tingkat kemiripan secara genetik. METODE Tempat dan Waktu Sampel penelitian dikumpulkan dan dieksplorasi dari habitat tumbuh liar Porang pada kawasan agroforestri yang ada di Sulawesi Selatan yakni Kabupaten Maros, Kabupaten Bulukumba, dan Kabupaten Bantaeng. Analisis molekuler dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Penelitian berlangsung selama tiga bulan yaitu pada bulan April hingga Juni 2023. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah meteran, gunting, cutter, linggis, cangkul, sekop kecil, ember, penggerus (mortar, blue pestle, gotri/magnetic bead), tabung mikro steril ukuran 2 dan 1,5 mL, pipet mikro (10 µL, 100-200 µL dan 1000 µL), sudip, tips ukuran (10 µL, 100-200 µL, 1000 µL), rak tabung, vortex, waterbath, sentrifuse, fume hood/lemari asam, lemari pendingin/kulkas, tabung PCR (250 µL), tip pipet (ukuran 10 µL, 100-200 µL dan 1000 µL), tabung mikro 1,5 mL, pipet 10 (ukuran 10 µL, 100-200 µL dan 1000 µL), pipet Multichannel 8 atau 12 channel (bila ada, sesuai kebutuhan), sentifugasi, Thermal Cycle T-100 (BIORAD), erlemenyer, perlengkapan elektroforesis gel agarose (cetakan dan tangka elektroforesis), wadah plastik untuk pewarnaan DNA, UV Tray, Gel DOC EZ Imager (BIORAD), nanodrop spektofotometer 2000, Software NTSYS-pc Versi 2.02i. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 sampel Porang masing-masing 10 sampel tiap lokasi (Tabel 1), 10 primer RAPD yakni OPA-02 (TGCCGAGCTG), OPA-03 (AGTCAGCCAC), OPA-09 (GGGTAACGCC), OPA-13 (CAGCACCCAC), OPA-14 (TCTGTGCTGG), OPC-08 (TGGACCGGTG), OPC-11 (AAAGCTGCGG), OPC-14 (TGCGTGCTTG), OPD-10 (GGTCTACACC), dan OPE-03 (CCAGATGCAC), silika gel, nitrogen cair, buffer ekstraksi (2% (w/v) CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide), 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA dan 1,4 mM NaCl), 2% (w/v) PVP (Polyvlnyl purrolidone), 0,38% (w/v) natrium disulfit, chloroform : isoamyl alcohol (24:1), isopropanol/etanol absolut dingin, etanol 70% dingin, 3M Natrium asetat pH 5,2, RNase A (10 ng/µL), Gel agarose, lambda DNA (100 ng/µL, 200 ng/µL, dan 50 ng/µL), 0,5 X TBE (Tris-buffer EDTA), loading dye, Etidium Bromide (Pewarna DNA), 100 bp Ladder DNA, Es, ddH2O (Nuclease Free Water), Kit PCR (Buffer PCR 10X, MgCl2, dNTPs, Primer, Tag DNA polymerase atau kit PCR Ready Mix, dan DNA template 92 Keragaman Genetik Genotipe Porang berdasarkan penanda RAPD Pelaksanaan Penelitian Pengambilan sampel Penelitian ini menggunakan sampel daun Porang yang diambil dari beberapa kawasan agroforestri di Sulawesi Selatan yaitu Kabupaten Maros (Lingkungan Malisu Kelurahan Cempa Niga Kecamatan Camba dengan ketinggian 400 m), Kabupaten Bulukumba (Desa Balang Pesoan Kecamatan Bulukumpa), dan Kabupaten Bantaeng (Dusun Borong Ganjeng, Desa Bonto Macini, Kecamatan Sinoa ketinggian 486 mdpl). Luasan area pada pengambilan sampel sebesar 10.000 m2. Teknik pengambilan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah simple random sampling yaitu cara pengambilan sampel dari anggota populasi tanpa memperhatikan tingkatan dalam anggota populasi tersebut. Pola pengambilan sampel dilakukan dengan pola diagonal. Setiap memasuki kawasan agroforestri dan saat pengambilan sampel, didokumentasikan menggunakan aplikasi kamera yang telah didikung fitur koordinat. Sampel daun yang digunakan adalah daun yang masih muda dan sehat. Daun muda yang telah diambil kemudian disimpan dalam plastik kedap udara yang telah diberi label sampel dan silika gel. Ekstraksi Porang Ekstraksi DNA menggunakan metode Ashan et al., (2020) yang telah dimodifikasi. Sampel daun diekstraksi menggunakan nitrogen cair dan digerus menggunakan mortar. Penambahan 1000 µl buffer ekstraksi (2% (w/v) CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM EDTA, 1,4 mM NaCl) pada sampel daun menggunakan tube berukuran 2 ml. Inkubasi sampel pada pada water bath suhu 65oC selama 5 menit agar terjadi homogenisasi. Penambahan 800 µl chloroform: Isoamylalcohol (24:1). Sampel disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit (20oC). Supernatan dipindahkan pada tabung baru sebanyak 600 µl. Penambahan larutan 3M Natrium asetat pH 5.2 sebanyak 1/10 x volume supernatan. Sedangkan penambahan larutan isopropanol dingin sebanyak 1 x volume supernatan. Inkubasi sampel pada suhu -20oC selama 60 menit untuk mengendapkan DNA. Selanjutnya, disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm (10oC) selama 10 menit. Apabila pelet telah terbentuk di dasar tube, selanjutnya supernatan dibuang dan pelet yang tersisa didasar tube dibilas menggunakan 500 µl ethanol 70% dingin. Sampel kemudian di-sentrifuse pada 12.000 rpm (10oC) selama 5 menit. Supernatan kembali dibuang dan pelet yang terbentuk kemudian dikeringanginkan pada suhu ruang selama semalaman. Selanjutnya pelet DNA dilarutkan menggunakan 100 µL laturan 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0 dan 1 mM EDTA) dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 65oC. Penambahan enzim RNase (10 ng/µl) sebanyak 2 µl, sampel diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Sampel DNA selanjutnya dapat diuji kuantitas maupun kualitasnya, jika larutan stok masih kotor, dilakukan tahap purifikasi DNA sebelum disimpan pada suhu -20oC. Purifikasi DNA Porang Proses purifikasi menggunakan larutan chloroform: isoamyl alcohol (24:1) sebanyak 600 ml yang disentrifuse pada 12.000 rpm selama 25 menit. Sampel DNA pada tube baru ukuran 1,5 ml. Penambahan 3 M Natrium asetat (NaOAc) sebanyak 50 µl dan 600 µl isopropanol dingin. DNA dihomogenkan hingga terlihat benang-benang DNA hasil isolasi. Hasil tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan di sentrifuse larutan DNA pada 13.000 rpm selama 10 menit. Penambahan 400 ml etanol 70% dan disentrifuse pada 13.500 rpm selama 10 menit agar homogen. Hasil pelet DNA dikeringkan pada suhu ruang semalaman. Uji kualitas, Kuantitas dan Pengenceran DNA dengan Spektrofotometer Pengukuran DNA secara kuantitatif dilakukan dengan menggunakan nanodrop spektrofotometer dengan perbandingan absorbansi pada λ260/ λ280 (Hikmatyar et al., 2015). Prinsip kerja nanodrop 93 Ashan et al. spektrofotometer ialah DNA murni mampu menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan pirimidin (Permata et al., 2014). DNA berkualitas baik berdasarkan uji nanodrop memiliki kemurnian 1,8-2,0 dan konsentrasi di atas 100 ng/µl (Hikmatyar et al., 2015). Uji kuantitatif dilakukan dengan absorbansi pada Panjang gelombang 260 nm menggunakan spektrofotometer (Novita et al., 2014). Konsentrasi DNA ditentukan dengan persamaan: [DNA] = A260 x 50 x faktor pengenceran. (A260: absorbansi pada pajang gelombang 260 nm; 50: larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 µg untai ganda DNA). Untuk DNA stok dilakukan pengenceran hingga mendapatkan konsentrasi larutan pengenceran berkisar 2-5 ng/ µl yang digunakan sebagai larutan pengujian PCR. Amplifikasi DNA Porang dengan Thermal Cycle T-100 (BIORAD) Amplifikasi PCR diawali dengan membuat larutan PCR Kit dengan volume akhir untuk 20 sampel sebagai berikut: Primer: 0,8 µl x 20 sampel=16 µl, ddH2O: 12,32 µl x Jumlah Sampel=246 µl, Buffer: 4 µl x Jumlah Sampel=80 µl, Enzim: 0,16 µl x Jumlah Sampel=3,5 µl. Pembuatan larutan pereaksi PCR dilakukan diatas cooler box. Konsentrasi akhir total DNA diperkirakan sebesar 20 µl sesuai program PCR yang telah dibuat. Reaksi PCR dengan menggunakan Thermal Cycle T-100 (BIORAD) selama 45 siklus. Pra-PCR pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian diikuti oleh 45 siklus yang terdiri atas denaturasi 1 menit pada suhu 94oC, penempelan primer 1 menit pada suhu 36oC, dan 2 menit pemanjangan pada suhu 72oC. Setelah 45 siklus selesai, kemudian diikuti pasca-PCR 4 menit pada suhu 72oC dan pendinginan pada suhu 4oC selama 30 menit (Probojati et al., 2019). Visualisasi produk PCR dengan Elektroforesis gel agarosa 1% Penyiapan gel agarose 1 % (volume 500 ml): sebanyak 1/100 gel agarose x 500 ml sehingga didapatkan 0,5 g. Agarose dilarutkan dengan larutan 0,5 X TBE menggunakan microwave. Gel yang telah polimerisasi sempurna dan membeku diletakkan di tangki elektroforesis. Penambahan produk PCR sebanyak 5 µl dimulai pada sumur ke-2 sampai selesai. Sumur ke-1 ditambahkan ladder ukuran 100 bp sebanyak 2 µl. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80V selama 50 menit. Pewarnaan DNA menggunakan larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama 10 menit, sedangkan perendaman gel dalam aquades selama 5-10 menit. Selanjutnya, gel diletakkan diatas wadah Gel Doc yang siap disinari UV dan didokumentasikan menggunakan kamera. Analisis Data Molekuler Skoring lokus dilakukan menggunakan software Genetik Analyzer 2010 maupun secara manual. Setiap pita dianggap sebagai satu lokus sehingga pita yang sama dari contoh tanaman diinterpretasikan sebagai satu lokus yang homolog. Lokus tersebut diubah ke dalam bentuk data biner dengan memberi nilai satu (1) untuk yang memiliki pita dan nilai nol (0) untuk yang tidak memiliki pita. Skoring data biner dilakukan pada sheet Microsoft Excel. Data yang diperoleh dari hasil skoring elektroforesis pada RAPD berupa data biner, selanjutnya dilakukan analisis gerombol (cluster analysis) dengan teknik berhierarki yang ada dalam program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System versi 2.02i (NTSYS) metode Sequential, Agglomerative, Hierarchical, and Nested Clustering (SAHN). Ukuran derajat jarak kemiripan genetik tanaman jarak pagar yang diamati berdasarkan koefisien kemiripan (similarity coefficient) atau jarak genetik (genetic distance) dengan menggunakan metode Group Average Clustering, dalam program NTSYS dipilih metode Unweight Pair Group Method Arithmetic (UPGMA). Estimasi kemiripan genetik diperoleh berdasarkan jumlah pita yang dimiliki bersama. Pengelompokan data matriks dan pembuatan dendogram dilakukan dengan metode UPGMA, fungsi Similarity Qualitative (SIMQUAL) (Jamshidi dan Jamshidi, 2011). 94 Keragaman Genetik Genotipe Porang berdasarkan penanda RAPD HASIL DAN PEMBAHASAN Purifikasi DNA Porang Nilai kemurnian DNA diperoleh menggunakan metode spektrofotometer pada rasio absorbansi λ260/λ280 dan nilai konsentrasi DNA. DNA berkualitas baik memiliki kemurnian 1,8-2,0 (Mollah et al., 2022). Berikut ini disajikan hasil pengukuran uji kualitas dan kuantitas DNA Porang setelah dipurifikasi pada Tabel 1. Tabel 1. Hasil Uji Kuantitas DNA Stok Porang Setelah Purifikasi No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MR1 MR2 MR3 MR4 MR5 MR6 MR7 MR8 MR9 MR10 BL1 BL2 BL3 BL4 BL5 Konsentrasi Konsentrasi λ260/ λ280 No Sampel (ng/µL) (ng/µL) 271,5 1,11 16 BL6 326,2 161,2 1,6 17 BL7 47,3 276 1,66 18 BL8 389,8 460,5 1,53 19 BL9 369,6 255 1,86 20 BL10 348,9 328,6 1,86 21 BT1 1162 204 1,84 22 BT2 189,3 156,7 1,94 23 BT3 91,9 137 1,86 24 BT4 417,1 117,1 1,91 25 BT5 304,5 351,3 1,42 26 BT6 374,4 710 1,39 27 BT7 103,4 585,5 1,22 28 BT8 336,1 853,1 1,3 29 BT9 184,6 213,1 1,33 30 BT10 516,1 λ260/ λ280 1,62 1,34 1,57 1,57 1,42 1,21 1,3 1,37 1,21 1,38 1,45 1,47 1,51 1,51 1,29 Keterangan: MR: Maros, BL: Bulukumba, dan BT: Bantaeng; λ260/ λ280: Panjang gelombang menunjukkan kemurnian DNA (Sumber: Data Primer, 2023). Hasil pengujian terhadap seluruh sampel, diperoleh rasio absorbansi λ260/λ280 yang beragam yakni berkisar antara 1,11 – 1,94 (Tabel 1). Nilai di bawah 1,8 menunjukkan kontaminan protein dan polisakarida yang tinggi. Sebaliknya, nilai yang lebih dari 2 “dua” menunjukkan kontaminan RNA yang cukup tinggi pada hasil isolasi (Tarigan, 2016). Keberadaan kontaminan menyebabkan serapan panjang gelombang 280 nm meningkat, sehingga rasio absorbansi semakin rendah yang mengakibatkan nilai absorbansi berada dibawah angka yang telah ditetapkan (Mollah et al., 2022). Amplifikasi DNA dengan Primer RAPD Amplifikasi RAPD menggunakan 10 primer RAPD yaitu: OPC-11, OPC-14, OPA-14, OPA-09, OPA13, OPC-08, OPA-03, OPA-02, OPD-10, dan OPE-03. Seluruh primer menunjukkan visualisasi yang sangat baik, dimana tiga diantaranya yaitu primer OPC-11 (Gambar 1), primer OPA-9 (Gambar 2) dan primer OPA-14 (Gambar 3). 95 Ashan et al. Gambar 1. Elektroforegram Amplifikasi DNA Porang dengan OPC-11, ket; M: marker ladder 100 bp, MR: Maros, BL: Bulukumba, dan BT: Bantaeng. Gambar 2. Elektroforegram Amplifikasi DNA Porang dengan OPA-09, ket; M: marker ladder 100 bp, MR: Maros, BL: Bulukumba, dan BT: Bantaeng. Gambar 3. Elektroforegram Amplifikasi DNA Porang dengan OPA-14, ket; M: marker ladder 100 bp, MR: Maros, BL: Bulukumba, dan BT: Bantaeng. Identifikasi pita polimorfik dilakukan berdasarkan konsistensi kemunculan pita DNA, ketebalan pita DNA, ukuran pita DNA dan segregasi pada pita DNA (Adriansyah et al., 2018). Berdasarkan hasil amplifikasi 10 primer, terdapat tingkat persentase polimorfik, persentase tertinggi pada OPA-14 (100%), OPA-02 (78%), dan OPC-08 (67,7%). Sedangkan persentase polimorfik terendah pada OPC-11 (49%). Pita polimorfik tersebut tersebar pada rentang 100 bp hingga 1500 bp. Hasil penelitian pada analisis RAPD untuk mendeteksi variabilitas genetik kedelai mutan menunjukkan 11 primer menghasilkan 100% pita polimorfik, diantanya OPA-02, OPA-07, OPA-10, OPA-11, OPA-12, OPA-13, OPA-14, 96 Keragaman Genetik Genotipe Porang berdasarkan penanda RAPD OPA-15, OPA-16, OPA-18 dan OPA-20 (Wahyudi et al., 2020). Selain itu, hasil penelitian tanaman pisang raja menunjukkan bahwa dari 12 primer RAPD yang teramplifikasi pada 13 kultivar dengan jumlah pita polimorfik sebanyak 115 pita dari 121 pita (ukuran 100 bp hingga 1500 bp), jumlah pita terbanyak dihasilkan dari primer OPA-02, OPA-4 dan OPA-17 (Probojati et al., 2019). Hubungan Kekerabatan Tanaman Porang Berdasarkan Penanda Molekuler RAPD Analisis hubungan kekerabatan terhadap tanaman Porang berdasarkan penanda molekuler RAPD dilakukan dengan analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pola pita DNA menggunakan software NTSYS-pc Versi 2.02i (Gambar 4). Klp. 1 Klp. 4 Gambar 4. Klp. 2 Klp. 3 Pohon filogenetik kekerabatan 30 Tanaman Porang (Amorphophallus muelleri Blume) Berdasarkan Penanda Molekuler RAPD Pada Software NTSYS-pc Versi 2.02i, ket; MR: Maros, BL: Bulukumba, dan BT: Bantaeng. Analisis kekerabatan pada 30 sampel tanaman Porang berdasarkan penanda molekuler RAPD memiliki tingkat kemiripan koefisien 0,50 – 1,00. Pada hasil tingkat koefisien kemiripan, tanaman Porang dikelompokkan menjadi empat kelompok. Pada kelompok I terdiri dari 24 tanaman yaitu MR1, BL5, BL10, BL1, MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, BL9, BT17, BL8, BT8, MR6, BT9, MR7, BL7, MR10, BT10. Sampel MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, dan BL9 yang memiliki tingkat koefisien kemiripan sebesar 1,00. Begitu pula BL8 dengan BT8. Kelompok dua terdiri dari dua tanaman yaitu BT1 dan MR8 dengan kemiripan 0,83. Kelompok 3 terdiri dari dua sampel yaitu MR2 dan BT2 dengan kemiripan 0,75. Kelompok 4 terdiri dari satu sampel yaitu BL2 dan MR9 dengan kemiripan 0,50. Tingkat koefisien kemiripan MR1, BL5, BL10, BL1, BT7, MR6, BT9, MR7 BL7, MR10, BT10, BT1, MR8, MR2, dan BT2 antara 0,55 - 0,92. Berdasarkan penanda molekuler RAPD, hasil amplifikasi DNA dengan 10 primer sangat dipengaruhi oleh situs perlekatan primer pada cetakan DNA. Sebaran situs penempelan primer pada DNA menyebabkan satu pita DNA diamplifikasi dalam jumlah banyak. Primer RAPD dimungkinkan untuk perlekatan primer secara acak (Probojati et al., 2019). Pemilihan primer pada analisis keragaman genetik berpengaruh terhadap polimorfisme pita yang dihasilkan, karena setiap primer memiliki situs penempelan tersendiri (Rahman et al., 2017). Oleh karena itu, pita DNA polimorfik yang dihasilkan setiap primer menjadi berbeda, baik dalam ukuran banyaknya pasang basa maupun jumlah pita DNA 97 Ashan et al. (Poerba dan Ahmad, 2013). Selain itu, hasil akurasi dalam pengelompokkan kultivar pisang dengan genom yang sama, dipengaruhi oleh pita DNA polimorfik yang dihasilkan oleh setiap primer berbeda dalam amplifikasi, baik dalam ukuran jumlah pasangan basa maupun jumlah pita DNA (Probojati et al., 2019). KESIMPULAN Hubungan keragaman genetik tanaman Porang dapat diklasterisasi menjadi empat kelompok. Kelompok I terdiri dari 24 tanaman yaitu MR1, BL5, BL10, BL1, MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, dan BL9, BT17, BL8, BT8, MR6, BT9, MR7, BL7, MR10, BT10. Kelompok dua terdiri dari dua tanaman yaitu BT1 dan MR8 dengan kemiripan 0,83. Kelompok 3 terdiri dari dua sampel yaitu MR2 dan BT2 dengan kemiripan 0,75. Kelompok 4 terdiri dari satu sampel yaitu BL2 dan MR9 dengan kemiripan 0,50. Sampel MR3, BL3, BT3, MR4, BL4, BT4, MR5, BT5, BL6, BT6, dan BL9 yang memiliki tingkat koefisien kemiripan sebesar 1,00. Begitu pula BL8 dengan BT8 DAFTAR PUSTAKA Adriansyah, F., Hanum, L., Muharni, M., & Windusari, Y. (2018). Analisis Polimorfisme Padi Varietas Lokal Sumatera Selatan Berdasarkan Pendekatan PCR-RAPD. J. Lahan Suboptimal, 7(1), 50–58. Aisah, B. N., Soegianto, A., & Basuki, N. (2017). Identifikasi Morfologi dan Hubungan Kekerabatan Tanaman Porang (Amorphophallus muellery Blume) di Kabupaten Nganjuk, Madiun, dan Bojonegoro. Jurnal Produksi Tanaman, 5(6), 1035–1043. http://protan.studentjournal.ub.ac.id/ index.php/protan/article/view/475 Ashan, M. D., Miftahudin, Reflinur, Pabendon, M. B., Santoso, S. B., & Salim, A. (2020). Qtl mapping linked to downy mildew resistance genes in Maize (Zea mays). Biodiversitas, 21(8), 3735–3743. https://doi.org/10.13057/biodiv/d210841 Hidayah, N., Suhartanto, M. R., & Santosa, E. (2018). Pertumbuhan dan Produksi Benih Iles-iles (Amorphophallus muelleri Blume) Asal Teknik Budi Daya yang Berbeda. Buletin Agrohorti, 6(3), 405–411. https://doi.org/10.29244/agrob.v6i3.21109 Hikmatyar, M. F., Royani, J. I., & Dasumiati. (2015). Isolasi dan amplifikasi DNA Keladi Tikus (Thyponium flagelliform) untuk identifikasi keragaman geentik. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia (JBBI), 2(2), 42. https://doi.org/10.29122/jbbi.v2i2.507 Jamshidi, S., & Jamshidi, S. (2011). NTSYSpc 2.02e Implementation in Molecular Biodata Analysis (Clustering, Screening, and Individual Selection). International Conference on Environmental and Computer Science, January 2011, 165–169. https://www.researchgate.net/publication/268270321 Masniawati, A., Johannes, E., Magfira, & Tuwo, M. (2023). Analisis Glukomanan Umbi Porang (Amorphophallus Muelleri Blume) dari Beberapa Daerah di Sulawesi Selatan. Ilmu Alam Dan Lingkungan, 14(2), 1–10. http://journal.unhas.ac.id Mollah, A., Ashan, M. A., & Khatimah, A. H. (2022). Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Porang (Amorphophallus Muelleri Blume) pada Beberapa Kawasan di Sulawesi Selatan. Jurnal Agritechno, 15(01), 1–7. https://doi.org/10.20956/at.v15i1.688 Nikmah, I. A., Azrianingsih, R., & Wahyudi, D. (2016). Genetic Diversity of Porang Populations (Amorphophallus Muelleri Blume) In Central Java and West Java Based on LEAFY Second Intron Marker. Journal of Tropical Life Science, 6(1), 23–27. https://doi.org/10.11594/jtls.06.01.05 Novita, L., Haska, N., Surahman, M., & Wahyu, Y. (2014). Pendugaan Parameter Genetik Karakter Morfo-Agronomi dan Seleksi Genotipe untuk Perbaikan Genetik Jarak Pagar. J. Agron. Indonesia, 42(3), 236–243. https://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnalagronomi/article/download/9181/7223/ Permata, R., Riniatsih, I., & Radjasa, O. K. (2014). Potensi pigmen karotenoid bakteri endofit lamun Thalassia hemprichii sebagai sumber senyawa alami penangkal radikal bebas DPPH (1,1-Difenil2-Pikrilhidrazil). Journal of Marine Research, 3(3), 294–303. http://ejournals1.undip.ac.id/index.php/jmr/article/view/6001 98 Keragaman Genetik Genotipe Porang berdasarkan penanda RAPD Poerba, Y. S., & Ahmad, F. (2013). Analisis keragaman genetik Musa balbisiana colla berdasarkan marka RAPD dan ISSR* [Genetic variation analyses of Musa balbisiana Colla based on RAPD and ISSR markers]. Berita Biologi, 12(2), 259–267. Porang Research Center. (2023). Variasi kandungan glukomanan dan hubungan kekerabatan menggunakan penanda RAPD pada berbagai varian Amorphophallus variabilis blume asal Tuban. Pusat Penelitian Dan Pengembangan Porang Indonesia. https://porang.ub.ac.id/media.php?module=detailjurnal&judul=variasi-kandungan-glukomanandan-hubungan-kekerabatan-menggunakan-penanda-rapd-pada-berbagai-varian-amorphophallusvariabilis-blume-asal-tuban Probojati, R. T., Wahyudi, D., & Hapsari, L. (2019). Clustering Analysis and Genome Inference of Pisang Raja Local Cultivars (Musa spp.) from Java Island by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Marker. Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 4(2), 42–53. https://doi.org/10.22146/jtbb.44047 Rahayuningsih, Y. (2020). Strategi Pengembangan Porang (Amorphophalus Muelleri) Di Provinsi Banten. Jurnal Kebijakan Pembangunan Daerah, 4(2), 77–92. https://doi.org/10.37950/jkpd.v4i2. 106 Rahman, M. O., Rahman, M. Z., Sony, S. K., & Islam, M. N. (2017). Genetic variation and molecular relationships among eight taxa of Desmodium desv. based on RAPD markers. Bangladesh Journal of Plant Taxonomy, 24(2), 149–154. https://doi.org/10.3329/bjpt.v24i2.35110 Rofik, K., Setiahadi, R., Puspitawati, I. R., & Lukito, M. (2017). Potensi Produksi Tanaman Porang (Amorphophallus muelleri Blume) di Kelompok tani MPSDH Wono Lestari Desa Padas Kecamatan Dagangan Kabupaten Madiun. AGRI-TEK: Jurnal Ilmu Pertanian, Kehutanan Dan Agroteknologi, 17(2), 53–65. https://download.garuda.kemdikbud.go.id/article.php?article =970078&val=14929&title Saleh, N., St.A., . Rahayuningsih, Radjit, B. S., Ginting, E., Harnowo, D., & Mejaya, I. M. J. (2015). Tanaman Porang: Pengenalan, Budidaya, dan Pemanfaatannya (A. Winarto (ed.); 1st ed.). Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. https://repository.pertanian.go.id/server/api/core/ bitstreams/cdc93535-5136-41a0-9734-52dcdfab548c/content Sari, R., & Suhartati. (2015). Tumbuhan Porang: Prospek budidaya sebagai salah satu sistem agroforestry. Info Teknis EBONI, 12(2), 97–110. Setyono, R. N., Wasi’, A., Rahmawati, Y., & Taufany, F. (2021). Pra-Desain Pabrik Konnyaku dari Tepung Glukomanan Umbi Porang (Amorphophallus Oncophyllus). Jurnal Teknik ITS, 10(2), 171–176. https://doi.org/10.12962/j23373539.v10i2.69690 Tarigan, S. M. (2016). Penggunaan marka molekuler RAPD untuk identifikasi hibrida F1 Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq). Jurnal Penelitian Pertanian BERNAS, 12(2), 30–43. Wahyudi, D., Hapsari, L., & Sundari. (2020). RAPD Analysis for Genetic Variability Detection of Mutant Soybean (Glycine max (L.) Merr). Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 5(1), 68–77. https://doi.org/10.22146/jtbb.53653 Zhao, C., She, X., Liu, E., Harijati, N., Cheng, T., Hu, Z., Jin, S., & Diao, Y. (2020). Screening of the candidate DNA barcodes for three important amorphophallus species identification. Agronomy, 10(9), 1–14. https://doi.org/10.3390/agronomy10091366 99