Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmac.
: 44 Ae 49 ISSN : 2442-8744 .
http://jurnal.
id/jurnal/index.
php/Galenika/index DOI : 10.
22487/j24428744.
Uji Pendahuluan Anti-biofilm Esktrak Teh Hijau dan Teh Hitam Pada Streptococcus mutans melalui Metode Microtiter Plate (An initial study on anti-biofilm activity of green tea dan black tea extracts on Streptococcus mutans via mictotiter plate assay ) Andi Arjuna.
Winda Setya Pratama.
Sartini.
Mufidah Fakultas Farmasi.
Universitas Hasanuddin.
Makassar.
Indonesia, 90245 Article Info:
Received: 02 Maret 2018 in revised form: 16 Maret 2018 Accepted: 30 Maret 2018 Available Online: 30 Maret 2018 Keywords:
black tea green tea microtiter plate Streptococcus mutans Corresponding Author:
Andi Arjuna Fakultas Farmasi Universitas Tadulako Makassar, 90245 Indonesia Mobile: 082345748488 Email: andiarjuna@unhas.
ABSTRACT
Tea (Camellia sinensis L.
) has activity as an antibacterial, widely studied to plankton cells, without further researching into biofilm cell.
Therefore, this research had been conducted to initially evaluate the activity of green and black tea extracts in inhibiting Streptococcus mutans biofilm.
Green and black tea leaves were extracted using 70% methanol.
Determination of MIC was subsequently performed by microdilution method.
Next, the biofilm formation and inhibition was run through microtiter plate method using flexible U-bottom PVC 96 wells, which then observed using microplate reader on = 515 nm.
As the results.
MIC for green and black tea extract stood at 4 mg/mL, 6 mg/mL, respectively.
The biofilm inhibitory activity of black tea extract was at 8 and 10 mg/mL inhibiting 6% and 12.
5% S.
Green tea extract showed that concentration of 4 to 10 mg/mL was able to inhibit biofilm growth by 24%.
48% and 53%.
Thus, through microtiter plate assay, it could be concluded that tea extract has potent antibiofilm to S.
mutans, where green tea extract has better activity than black tea extract.
Copyright A 2017 JFG-UNTAD This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.
0 International license.
How to cite (APA 6th Styl.
Arjuna.
, et al.
Uji Pendahuluan Anti-biofilm Ekstrak Teh Hijau dan Teh Hitam pada Streptococcus mutans melalui Metode Microtiter Plate.
Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy, 4.
, 44-49.
doi:10.
22487/j24428744.
Arjuna et al.
/Jurnal Farmasi Galenika (Galenica Journal of Pharmac.
: 44-49
ABSTRAK
Teh (Camellia sinensis L.
) telah diketahui memiliki aktivitas antibakteri yang sangat luas dipalajari terutama pada bakteri plankton, tanpa adanya penelitian yang dalam mengenai aktivitas biofilmnya.
Sehingga, telah dilakukan penelitian mengenai uji pendahuluan aktivitas ekstrak teh hitam dan teh hijau dalam menghambat biofilm Streptococcus mutans.
Daun teh hitam dan teh hijau masing-masing dimaserasi dengan metanol 70%.
Nilai KHM dari sampel tersebut selanjutnya ditentukan melalui metode makrodilusi.
Pembentukan dan penghambatan biofilm selanjutnya dilakukan melalui metode microtiter plate .
enggunakan well 96 yang fleksibel dan flat botto.
, dilanjutkan dengan pengamatan menggunakan microplate reader pada = 515 nm.
Nilai KHM ekstrak teh hijau dan teh hitam diperoleh masing-masing pada konsentrasi 4 mg/ mL dan 6 mg/ mL.
Hasilnya, ekstrak teh hitam dengan konsentrasi 8 dan 10 mg/ mL mampu menghambat biofilm S.
mutans masingmasing sebesar 6% dan 12.
Sedangkan pada esktrak teh hijau konsentrasi 4 sampai 10 mg/ mL menghambat biofilm S.
mutans masing-masing 24%.
48%, dan 53%.
Sehingga, melalui metode microtiter plate dapat disimpulkan bahwa semua ekstrak teh memilki potensi besar sebagai antibiofilm S.
mutans, dimana ekstrak hijau menunjukkan aktivitas yang lebih baik dibandingkan ekstrak teh hitam.
Kata Kunci : biofilm, microtiter plate.
Streptococcusmutans, teh hijau, teh hitam antibiotika diketahui dapat dicegah dengan cara menghambat aktivitas QS antar mikroba, dengan pembentukannya, penetrasi antibiotika akan lebih mudah terhadap mikroba target (Amaya et al, 2012.
Chu et al, 2013.
Jimynez-Gymez et al, 2007.
Kim et al, 2015.
Koh & Tham, 2.
PENDAHULUAN
Biofilm merupakan salah satu produk hasil interaksi dari quorum sensing (QS) dari masing-masing Proses pembentukan biofilm diawali ketika mikroba soliter melekat pada suatu permukaan yang cocok, selanjutnya akan menempel dan mengeluarkan signal QS.
Pada saat terjadi komunikasi, bakteri akan mengeluarkan signal .
untuk memanggil bakteri-bakteri lainnya (Irie & Parsek, 2.
Mikroorganisme, baik bakteri gram positif -gram negatif maupun fungi mempunyai sistem QS yang berbeda-beda.
Pada bakteri gram negatif menghasilkan signal AHL (Acyl homserine lactone.
, bakteri gram positif menghasilkan signal peptida, sedangkan pada fungi menghasilkan senyawa farnesol ataupun tirosol sebagai sistem quorum sensing antar selnya (Kalia, 2013.
Kim et al.
Setelah mengeluarkan signal QS, bakteri akan mensekresikan EPS .
xtracellular polymeric substanc.
sebagai matriks pelindung yang kokoh.
Setelah itu, bakteri membentuk mikrokoloni dan akan berkembang membentuk biofilm (Michael et al.
Studi penghambatan terbentuknya biofilm sekarang ini telah banyak dilakukan untuk mengevaluasi kemampuan berbagai esktrak yang memilki aktivitas Salah satu tanaman yang dikenal memiliki aktivitas antibakteri yaitu tanaman teh (Camellia sinensis L.
Teh mengalami proses pengolahan tertentu dan dikategorikan menjadi tiga, yaitu tanpa fermentasi .
eh hijau dan teh puti.
, semifermentasi .
eh mera.
dan melalui proses fermentasi .
eh hita.
(Bancirova, 2010.
McKay & Blumberg.
Penelitian-penelitian mengenai evaluasi aktivitas antibakteri dari tanaman teh (Camellia sinensis L.
telah banyak dilakukan terhadap bakteri plankton, penghambatan koloni biofilm pada bakteri.
Oleh karena itu, dalam penelitian ini telah dilakukan studi aktivitas antibiofilm dari ekstrak daun teh (Camellia sinensis L.
) hijau dan teh hitam terhadap bakteri Streptococcus bentuk uji pendahuluan kemampuan ekstrak ini dalam manipulasi pembentukan biofilm S.
Bakteri Streptococcus terbentuknya plak biofilm pada gigi yang memetabolisme sukrosa menjadi gula yang lengket (Kawarai et al, 2.
Meningkatnya resistensi mikroba, seperti pada bakteri Streptoccus mutans.
Staphylococcus aureus, dan Eschericia coli terhadap Arjuna et al.
/Jurnal Farmasi Galenika (Galenica Journal of Pharmac.
: 44-49
diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.
Konsentrasi terendah yang menghasilkan efek penghambatan tercatat sebagai KHM(Kaur et al.
Kawarai et al.
, 2.
Kontrol positif yaitu ListerineA dengan konsentrasi 45% v/v, media dan suspensi bakteri dan kontrol negatif.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah microplate reader (BiotekA), evaporator (HeidolphA), inkubator (MemmertA), lampu UV, seperangkat alat gelas (PyrexA), wells microplate 96 flat bottom.
Evaluasi pembentukan biofilm S.
Bahan yang digunakan adalah teh hitam, teh hijau .
iperoleh dari Malino Highland.
Sulawesi Selata.
, isolat bakteri Streptococus mutans(Lab Mikrobiologi Farmasi UNHAS).
Brain heart infusion broth (BHIB) (MerckA).
Nutrient broth (NB) (MerckA).
Nutrient Agar (NA)(MerckA).
DMSO, metanol, etanol 96%, kristal violet (MerckA).
Mouthwash (ListerineA).
Untuk Streptococcus mutans, dimasukkan 75 AAL BHIB 2% sukrosa dan 25 AAL suspensi bakteri .
,5 x 108 CFU / mL) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37AC.
Setelah inkubasi, microplates kemudian dibilas menggunakan air steril dan sumuran pada microplate diwarnai dengan 0,1% kristal violet selama 15 menit, kemudian dibilas, apabila microplates tetap berwarna ungu, maka telah terbentuk biofilm pada sumuran microplates(O'Toole, 2.
Metode Penyiapan sampel teh dan mikroba S.
Penyiapan sampel AeSampel dipersiapkan sesuai dengan prosedur standar ekstraksi sampel dengan maserasi, dengan sedikit penyesuaian jenis sampel dan penyarinya.
Sampel teh kering .
eh hijau dan teh hita.
sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam bejana maserasi dan direndam dalam cairan penyari metanol 70% sebanyak 50 mL .
, disimpan pada suhu ruang selama 3 hari sambil sesekali diaduk dan kemudian disaring.
Ampas yang diperoleh kemudian diekstraksi kembali.
Ekstrak metanol teh yang diperoleh kemudian digabung dan disaring menggunakan kertas Whatmann No.
1 dan filtrat yang didapatkan kemudian dipekatkan menggunakan evaporator dengan suhu dibawah 45AC hingga didapatkan ekstrak kental (Kaur.
Kaur, & Rana.
Kawarai et al.
, 2.
Evaluasi penghambatan biofilm S.
Penyiapan mikroba - Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar (NA)dan Brain Heart Infusion Broth (BHIB) yang dipersiapkan sesuai dengan prosedur .
Isolat bakteri uji S.
mutans diinokulasikan ke media NA miring dan inkubasi pada 37AC selama 24 jam (O'Toole, 2.
Seteleh variasi konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 mg/mL esktrak dipersiapkan, masing-masing sampel dimasukkan ke dalam microplates, ditambahkan 100 AAL suspensi bakteri S.
mutans dalam BHIBdan dicukupkan dengan media BHIB hingga 200 AAL.
Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37A C selama 24 jam.
Setelah diinkubasi, isi microplate dibuang dan dibilas dengan menggunakan air mengalir.
Sumuran microplate kemudian ditambahkan larutan 0,1 % kristal violet.
Setelah 15 menit, larutan kristal violet dibuang dan dibilas kembali menggunakan air.
Selajutnya microplate diisi dengan etanol 96% dan diinkubasi selama 15 menit.
Media BHIB dan suspensi bakteri sebagai kontrol negatif dan ListerineA 45% v/v sebagai kontrol positif, kontrol pelarut yaitu DMSO 20 % v/v.
Kontrol media yaitu hanya berisi media BHIB.
Biomasa dari lapisan biofilm diukur dengan menggunakan alat microplate reader dengan panjang gelombang 515 nm (O'Toole.
Penentuan Kadar Hambat Minimum Pengumpulan dan analisis data Penentuan nilai KHM dilakukan dengan metode broth micro dilution.
Masing-masing ekstrak daun teh dibuat larutan stok 20% dalam DMSO 20%.
Diambil masing-masing ekstrak dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 mg/mL, lalu dimasukkan dalam tabung reaksi dan dicukupkan hingga 1 mL dengan BHIB.
Suspensi bakteri Mc Farland setara 1,5 x 10 8 CFU/mL dalam BHIB .
sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
Selanjutnya Persentase penghambatan biofilm dihitung dengan menggunakan rumus berikut, (Pratiwi.
Lagendijk.
Hertiani.
De Weert, & Van Den Hondel, 2.
% ycyyceycuyciEaycaycoycaycaycycaycu = .
Oe ( yueycCyayc OeyueycCyaycoyca ))ycu100% yueycCyaycyca Keterangan :
ODt = Optical Density .
sumuran yang diuji ODmc =Optical Density kontrol media ODvc =Optical Density kontrol pelarut Arjuna et al.
/Jurnal Farmasi Galenika (Galenica Journal of Pharmac.
: 44-49
Data yang diperoleh dari pengujian nilai KHM dan pengukuran kuantitatif dari penghambatan biofilm.
Selanjutnya akan dilakukan pengumpulan dan analisis data berdasarkan hasil pengukuran yang telah Gambar 1 menunjukkan sumuran yang berwarna ungu (A) sebagai representatif terbentuknya biofilm mikroba, yaitu S.
Jika diamati dari samping warna ungu terbentuk merata pada dinding.
Hal ini disebabkan karena S.
mutans merupakan bakteri nonmotile.
Berbeda dengan bakteri yang melakukan pergerakan banyak, biasanya warna ungu sumuran akan terpusat pada permukaan atas sumuran.
Selain itu, sebagai bakteri anaerob fakultatif, biofilm yang terbentuk cenderung membentuk pola cincin pada permukaan sumuran yang mengindikasikan tetap oksigen(Kim et al.
, 2015.
O'Toole, 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas antibakteri dari ekstrak teh hijau dan teh hitam sebelumnya ditentukan dengann metode Nilai konsentrasi hambat dari kedua ekstrak ini masing-masing 4 mg/mL untuk ekstrak teh hijau, dan 6 mg/mL untuk esktrak teh hitam.
Kedua konsentrasi ini lebih tinggi dari nilai konsentrasi hambat minimumnya yang dirujuk dari berbagai pustaka yaitu 0,104 mg/mL untuk teh hijau 088 mg/mL untuk teh hitam (Kaur et al.
, 2.
Walaupun demikian, dengan mempertimbangkan sampel yang digunakan, maka konsentrasi hambat eksperimen dijadikan acuan dalam pengujian antibiofilm S.
mutans dari berbagai konsentrasi kedua Terbentuk dan stabilnya zat warna kristal violet pada biofilm S.
mutans yang menempel pada sumuran, pada dasarnya mengikuti mekanisme pengecatan gram pada umumnya.
Sebagai bakteri gram positif mutans memiliki susunan dinding sel yang kompak dengan lapisan peptidoglikan .
dan teichoic acid mampu mencegah sel protoplasnya mengalami lisis osmotik sekaligus penahan keluarnya zat warna kristal violet saat dibilas dengan dapar posfat (Kawarai et al.
, 2.
Pembentukan biofilm Presentase penghambatan Absorbansi .
Pembentukan biofilm Penghambatan biofilm Absorbansi .
Konsentrasi Ekstrak Teh Hitam .
g/mL) Presentase penghambatan Gambar 1.
Evaluasi pembentukan biofilm S.
mutans pada microplate 96 wells U-shape bottom.
Biofilm diklaim terbentuk (A), dan tidak terbentuk (B).
A merupakan campuran S.
mutans dan medium, sedangkan B merupakan medium tanpa S.
Setelah inkubasi 24 jam, masingmasing sumuran dicuci dan diwarnai dengan kristal violet Konsentrasi Ekstrak Teh Hijau .
g/mL) Gambar 2.
Efek ekstrak teh hitam .
dan esktrak teh hijau .
pada pembentukan dan penghambatan biofilm S.
Kuantitas yang digambarkan sebagai rata-rataASD dari tiga kali pengujian.
Presentase penghambatan biofilm Pembentukan dan evaluasi penghambatan biofilm dilakukan dengan metode mirotiter plate.
Untuk mengevaluasi biofilm yang dibentuk oleh S.
suspensi bakteri setara dengan 1,5 x 10 8 CFU/mL McFarland dimasukkan kedalam masing-masing sumuran .
icrotiter well.
, dicampurkan dengan Setelah masa inkubasi 24 jam, sumuran dicuci dan diwarnai dengan Kristal Violet 0.
1%, jika terbentuk warna ungu yang tidak tercuci maka banyaknya zat warna yang terikat diasumsikan sama dengan banyaknya biofilm mikroba pada sumuran (O'Toole, 2.
Arjuna et al.
/Jurnal Farmasi Galenika (Galenica Journal of Pharmac.
: 44-49
Stabilnya warna ungu pada sumuran kemudian dimanfaatkan untuk mengevauasi kemampuan ekstrak teh hijau dan teh hitam memanipulasi biofilm mutans yang terbentuk.
Pada gambar 2, walaupun .
mencapai 71%, kedua sampel ekstrak juga tetap menunjukkan kemampuan penghambatan terbentuknya biofilm yang signifikan.
KESIMPULAN
Ekstrak teh hijau dan teh hitam memiliki potensi sebagai anti-biofilm S.
mutans yang dievaluasi dengan metode microtiter plate.
Pada konsentrasi 10 mg/mL, ekstrak teh hijau memiliki potensi lebih tinggi .
%) dibandingkan dengan ekstrak teh hitam .
%) menghambat biofilm S.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ekstrak teh hijau memberikan hasil yang lebih signifikan dibandingkan dengan ekstrak teh hitam.
Misalnya pada konsentrasi 6 mg/mL saja, ekstrak teh hijau telah memiliki aktivitas penghambatan sebesar 45% dimana penghambatan oleh ekstrak teh hitam masih pada 1%.
Rata-rata pembentukan biofilm yang terbentuk pada umumnya juga ditekan oleh ekstrak teh hijau.
Pada konsentrasi terkecil pun, absorbansi pembentukan biofilm S.
mutans hanya mencapai 307 a.
u < 0.
468 a.
u oleh ekstrak teh hitam.
Penghambatan biofilm dari ekstrak teh hitam mulai efektif pada konsentrasi 8 mg/mL, sebesar 6% dan pada konsentrasi10 mg/mL yaitu sebesar 12,5%, sedangkan penghambatan ekstrak teh hijau pada kondisi yang sama adalah masing-masing 48% dan Terimakasih kepada Laboratorium Mikrobiologi Farmasi.
Farmakognosi-Fitokimia, dan Biofarmaka UNHAS sebagai sarana penunjang penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA