E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 Optimalisasi Ekstraksi DNA Dan PCR Untuk Identifikasi Molekuler Pada 4 Jenis Karang Lunak Berbeda Aradea Bujana Kusuma Jurusan Ilmu Kelautan.
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.
Universitas Papua.
Manokwari Papua Barat.
Indonesia *Corresponding author: aradea.
bujana@gmail.
Received: 31 Maret 2022.
Revised: 1 Juli 2022.
Accepted: 10 September 2022
ABSTRAK
Karang lunak merupakan salah satu penyusun komunitas karang yang berguna bagi ekosistem terumbu karang.
Keberadaanya di ekosistem terumbu karang sangat penting bagi proses rantai makanan di lautan.
Sulitnya identifikasi morfologi karang ini disebabkan variasi sklerit yang Oleh karena itu penting adanya identifikasi molekuler sebagai penunjang data taksonomi karang ini.
Akan tetapi, dalam proses identifikasi molekuler karang ini masih banyak hambatan yang terjadi dalam proses ekstraksi maupun PCR nya.
Hal ini dimungkinkan karena adanya kalsium karbonat yang tersusun di seluruh tubuh karang ini.
Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan proses ekstraksi DNA dan PCR yang optimal dalam proses identifikasi secara molekuler.
Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan Kit Ekstraksi dan PCR dengan menggunakan KIT PCR.
Hasil ekstraksi menunjukan bahwa Xenia sp memiliki konsentrasi DNA yang tertinggi dengan nilai 53.
g/u.
dan terendah pada jenis Sarcophyton trocheliophorum sebesar 26.
g/u.
Optimalisasi PCR menghasilkan hasil yang baik pada spesies Xenia sp.
dan Lobophytum pauciflorum sedangkan pada sampel jenis Sarcophyton trocheliophorum pita DNA menunjukan hasil yang smear.
Keywords: Ekstraksi.
Identifikasi.
Karang Lunak.
Molekuler.
PCR
ABSTRACT
Soft coral is the part of coral reef ecosystem that have important function for coral reef ecosystem.
The presence of soft coral in the coral reef ecosystem is crucial for the process of food chain in the ocean.
The difficulty of identified softcoral morphology due to diverse variations of sclerite.
Therefore, it is important to used molecular identification as supporting of taxonomic data of coral.
However, in the process of molecular identification there is still a lot of constraints that occurs in the extraction process and PCR.
It caused by the presence of calcium carbonate arranged throughout DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 the coral body.
The aim of this research was to known optimal processes of DNA extraction and PCR.
DNA Kit extraction and PCR KIT were used in this research.
The extraction results showed that Xenia sp had the highest concentration of DNA with a value of 53.
g/u.
and the lowest was for Sarcophyton trocheliophorum of 26.
g/u.
PCR optimization produced good results on Xenia sp.
, and Lobophytum pauciflorum species while on samples of Sarcophyton trocheliophorum DNA bands showed smear Keywords: Extraction.
Identification.
Molecular.
PCR.
Softcoral PENDAHULUAN Karang lunak merupakan invertebrata multiseluler yang banyak dijumpai di ekosistem terumbu karang.
Bentuk dan warnanya yang indah menjadikan karang ini primadona bagi para penyelam untuk dilihat.
Tubuhnya yang lunak sangat mudah untuk diamati perbedaanya dengan karang keras.
Hal ini dikarenakan karang lunak tidak membentuk terumbu.
Tubuh karang ini terdapat sklerit atau zat kapur yang terkandung didalam Sklerit ini berfungi untuk menompang dan memberi bentuk karang lunak agar tetap tegak.
Sklerit dalam tubuh karang lunak ini biasa digunakan sebagai karakterisasi dalam proses identifikasi morfologinya.
Akan tetapi, dalam proses identifikasinya, penggunaan sklerit ini sangat menyulitkan peneliti karena variasi bentuknya yang sangat banyak.
Selain itu juga penggunaan sklerit untuk identikasi mengharuskan mengambil seluruh bagian karang lunak ini untuk dibedah.
Oleh sebab itu metode ini tidak konservatif dalam Penggunaan metode identifikasi yang tepat sangat membantu pelestarian karang lunak ini di alam.
Salah satu metode identifikasi yang sedang berkembang saat ini adalah metode molekuler.
Metode identifikasi menggunakan metode molekuler telah banyak dilakukan untuk identifikasi ikan kerapu (Tapilatu, 2020.
Dwifajriani, 2.
dan hiu berjalan (Tapilatu, 2.
Sedangkan penggunaan analisis molekuler untuk karang lunak masih sangat kurang digunakan dalam proses identifikasi molekuler.
Metode molekuler ini memiliki beberapa tahap yang sangat penting dalam pelaksanaanya.
Tahap tersebut ialah tahap ekstraksi dan tahap PCR (Polymeras chain reactio.
Ekstraksi adalah tahap awal molekuler untuk memisahkan DNA dan sel-nya.
Sedangkan PCR atau biasa dikenal dengan amplifikasi merupakan suatu metode untuk memperbanyak jumlah DNA yang didapatkan setelah tahap ekstraksi.
Kedua metode ini merupakan metode yang menetukan berhasil tidaknya peneliti dalam melakukan identifikasi molekuler.
Akan tetapi dalam pelaksanaan identifikasi molekuler karang lunak, kedua tahap ini masih banyak dijumpai kendala.
Hal ini dikarenakan terdapat perbedaan tebal atau tipisnya jaringan pada spesies DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 yang berbeda pada hewan octocoralia ini.
Oleh karena itu, perlu adanya optimasi metode yang tepat sehingga dapat menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang bagus.
Kualitas dan kuantitas DNA yang baik dapat ditentukan oleh jenis sampel, primer yang digunakan dan juga suhu annealing yang digunakan dalam tahap amplifikasi (PCR).
Oleh karena itu, penting adanya penelitian yang mengkaji tentang konsentrasi hasil ekstraksi dan PCR yang optimal pada spesies karang lunak yang berbeda untuk memudahkan peneliti lainnya dalam proses identifikasi.
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Pengambilan Sampel Karang lunak Pengambilan sampel karang lunak dilakukan dengan menggunakan alat scuba untuk mengambil jaringan karang lunak.
Karang lunak yang akan di ambil di foto terlebih dahulu untuk proses identifikasi secara morfologi dan dilanjutkan pengambilan sampel jaringan.
Sampel jaringan diambil dengan cara non-destruktif yaitu dengan mengambil jaringan karang lunak hanya sepanjang 5 - 7 cm.
Jaringan karang lunak dipotong dengan menggunakan gunting, kemudian sampel yang telah didapatkan dibilas dengan menggunakan aquades steril.
Hal ini bertujuan untuk menghilangkan organisme simbion yang terdapat pada bagian permukaan jaringan karang lunak.
Kemudian sampel dimasukan kedalam 5 ml dan diawaetkan menggunakan ethanol 96% pro analisis.
Tahap berikutnya dilanjutkan dengan pemberian label menggunakan kertas kalkir.
Ekstraksi Jaringan Karang Lunak Proses ekstraksi diawali dengan pencucian jaringan karang lunak 5 cm dengan menggunakan aquades steril yang berguna untuk menghilangkan pengaruh ethanol.
Jaringan yang telah dicuci kemudian dihaluskan dengan menggunakan microsmash untuk mempermudah dalam tahapan lisis jaringan.
Jaringan yang telah halus kemudian diekstraksi dengan menggunakan kit ekstraksi Qiagen untuk darah dan jaringan.
Inkubasi dilakukan dengan memberikan tiga perlakukan terhadap lama waktu inkubasi yaitu 3 jam pada temperatur 56AC.
Selanjutnya proses ekstraksi dilakukan dengan mengikuti protokol dari kit Proses ekstraksi dilakukan seluruhnya dengan prinsip steril yaitu dengan cara mencuci bersih dan membakar pisau, pinset maupun gunting yang telah dipakai pada setiap sampel.
DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 Amplifikasi DNA dengan Menggunakan PCR Hasil ekstraksi yang didapatkan kemudian dilanjutkan ketahap amplifikasi untuk memperbanyak DNA.
Amplifikasi dilakukan dengan 16S647F:
5AoACACAGCTCGGtCTATCTACCA-3Ao ND21418R:
5AoACATCgAGCC CACATA-3Aountuk fragmen ND2.
(Sanchez et al.
, 2.
Primer ini mengamplifikasi DNA pada bagian mitokondria.
Sebanyak 3 l DNA direaksikan dengan 12,5 l Q5 high fidelity master mix, 7 l ddH2O, primer forward dan reverse masing-masing 1,25 l dengan total campuran 25 l.
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 2 perlakukan.
Perlakukan pertama menggunakan urutan pre-denaturation pada suhu 98AC selama 30 detik, denaturation pada suhu 98AC selama 30 detik, annealing pada suhu 56AC selama 30 detik dan extension pada suhu 72AC selama 30 serta final extention pada suhu 72AC selama 2 menit dalam 35 Sedangkan perlakukan kedua menggunakan urutan predenaturation pada suhu 98AC selama 30 detik, denaturation pada suhu 98AC selama 30 detik, annealing pada suhu 57AC selama 30 detik dan extension pada suhu 72AC selama 30 serta final extention pada suhu 72AC selama 2 menit dalam 35 siklus.
Penentuan perbedaan suhu annealing tersebut didasarkan selisih pada perhitungan asam basa pada primer forward dan reverse dengan rumus:
TA = 2 (A T) 4 (G C)
Ket :
= Temperatur Annealing G = Guanin = Adenin C = Cytosin = Timin Uji Kualitatif DNA Sinularia peculiaris.
Lobophytum pauciloflorum.
Sarcophyton trocheliophorum.
Xenia sp dengan menggunakan Nanodrop Spektrofotometer Hasil ekstraksi kemudian dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan Nanodrop Spektrofotometer.
Jumlah sampel hasil ekstraksi dan blanko yang digunakan yaitu sebanyak 1 l.
Proses ini dimulai dari uji blanko kemudian sampel DNA dan kemudian terakhir penggunaan blanko kembali.
Panjang gelombang yang digunakan yaitu A260/A280.
Visualisasi Hasil PCR dengan Menggunakan Metode Elektroforesis Elektroforesis dilakukan pada gel agarosa konsentrasi 1,5%.
Komposisi gel tersebut yaitu pewarna Etidium Bromidea .
dan larutan TAE 1X 100 ml dan agarose 1.
5 gram.
Kemudian larutan tersebut dididihkan dan dicetak kedalam cetakan yang memiliki sisiran untuk membentuk sumuran Hasil PCR sebanyak 4 l yang telah ditambahkan dengan loading dye .
, dimasukkan ke dalam sumur agarosa.
Setelah itu di DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 elektroforesis pada tegangan 100 V selama 25 menit.
Pita hasil
elektroforesis dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet pada UV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Ekstraksi Hasil ekstraksi pada 12 sampel karang lunak lunak yang terdiri dari 4 jenis seperti Sinularia peculiaris.
Lobophytum pauciloflorum.
Sarcophyton trocheliophorum.
Xenia sp mendapatkan berbagai rentang konsentrasi DNA.
Hasil rentang konsentrasi DNA yang diperoleh dari 8.
50 hingga 59.
g/u.
(Tabel .
Rata-rata konsentrasi DNA tertinggi pada jenis Xenia Sp.
Sebesar 53.
g/u.
di ikuti oleh Sinularia peculiaris sebesar 51.
g/u.
Lobophytum pauciloflorum sebesar 48.
g/u.
dan terkecil pada Sarcophyton trocheliophorum yaitu sebesar 26.
g/u.
Tingginya konsentrasi DNA pada Xenia sp.
dimungkinkan karena struktur jaringan karang lunak ini yang cenderung lebih lembek dibandingkan dengan spesies lain yang digunakan.
Lunaknya jaringan Xenia sp, mempermudah dalam proses penghancuran sel dan pemisahan DNA dari selulosa dan protein, sehingga DNA mudah di terekstraksi.
Berbeda dari Xenia sp, karang lunak Sinularia peculiaris.
Lobophytum pauciloflorum, dan Sarcophyton trocheliophorum memiliki struktur tubuh yang cenderung lebih keras dari pada Xenia sp.
Keberhasilan dari ekstraksi sangat tergantung dari jenis dan berat sampel tissue yang digunakan.
Menurut keberhasilan dari ekstraksi DNA dapat dipengaruhi oleh tingkat struktur sel dari suatu Hal ini mengacu pada tujuan dari proses ekstraksi itu sendiri yaitu untuk memisahkan kandungan lipid, polisakarida dan protein (Liana.
Tabel 1.
Hasil Uji Kualitatif Ekstraksi DNA menggunakan Nanodrop Spektrofotometer Rentang Konsentrasi DNA .
g/u.
Rata-rata DNA g/u.
Rentang
Nilai A260/A280 Rata-rata Nilai Mean
A260/A280
Sinularia peculiaris 7 Ae 53.
821Ae1.
Lobophytum 4 Ae 56.
862Ae1.
Sarcophyton 50 Ae 52.
591Ae1.
Xenia sp.
9 Ae 59.
782Ae1.
Sampel Berdasarkan pada rata-rata nilai mean A260/A280 sampel Sarcophyton trocheliophorum memiliki rata-rata yang paling kecil dibandingkan yang DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 sampel yang lain yaitu 1.
Hal ini dimungkinkan karena adanya kontaminasi pada hasil ekstraksinya.
Tebalnya jaringan karang lunak jenis Sarcophyton trocheliophorum memungkinkan adanya kontaminasi protein Menurut (Fatchiyah et al.
, 2011.
Kartini.
, 2.
nilai kemurnian kurang dari 1.
8 menunjukan adanya kontaminasi pada hasil ekstraksi yang berupa protein, karbohidrat atau fenol, sedangkan nilai lebih dari 2 telah terkontaminasi oleh RNA.
Hasil PCR Hasil analisis amplifikasi DNA pada 4 spesies karang lunak Sinularia peculiaris.
Lobophytum pauciloflorum.
Sarcophyton trocheliophorum.
Xenia menunjukan ketegasan pita DNA yang berbeda-beda.
Pada karang lunak jenis Sarcophyton trocheliophorum masih terdapat sampel hasil amplifikasi yang smear (Gambar 1.
Smear pada pita DNA hasil amplifikasi dimungkinkan karena adanya kontaminasi zat-zat seperti fenol, polisakarida dan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh karang lunak itu Menurut Nur et al, 2019 dan Sawant et al.
, 2006 karang lunak memiliki metabolit sekunder yang berfungsi sebagai racun untuk melawan predator yang mengancam kelangsungan hidupnya.
Smear yang dihasilkan pada proses elektroforesis disebabkan oleh 2 kemungkinan, yaitu adanya kontaminasi pada produk DNA dan adanya degradasi pada DNA (Mulyani et al.
, 2.
Adanya degradasi produk DNA yang dihasilkan dimungkinkan karena proses ekstraksi yang kurang baik sehingga menyebabkan terputusnya ikatan antar molekul DNA.
Misalnya saat proses penggerusan tissue maupun karena tenmperatur suhu yang terlalu tinggi saat inkubasi (Sisharmini et al.
, 2001.
Prayitno et al.
, 2011.
Harahap, 2.
Hal ini sesuai dengan hasil rata-rata konsentrasi DNA yang didapat yaitu kurang dari 1.
yang mengindikasikan adanya kontaminasi pada proses ekstraksi.
Hasil amplifikasi pada jenis karang lunak Sinularia peculiaris menunjukan bahwa pita DNA yang dihasilkan tidak terlalu tebal (Gambar Tipisnya pita DNA pada sampel ini dimungkinkan karena adanya degradasi pada sampel ekstraksinya.
Menurut Biorad .
bahwa hasil pita DNA yang tipis pada proses amplifikasi dimungkinkan karena waktu siklus dan suhu amplifikasi yang tidak sesuai, selain itu komposisi PCR seperti banyaknya cetakan DNA yang digunakan juga berpengaruh pada hasil amplifikasi.
Konsentrasi DNA yang tinggi pada cetakan DNA yang digunakan pada amplifikasi dapat menggangu proses amplifikasi.
Hal ini sesuai dengan hasil konsentrasi DNA pada proses ekstraksi yang tinggi pada sampel karang lunak Sinularia peculiaris.
Oleh karena itu harus ada penyesuain banyaknya jumlah cetakan DNA yang digunakan pada amplifikasi sesuai dengan konsentrasi hasil ekstraksi DNA.
DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 Gambar 1.
Pita DNA hasil ampilifikasi pada Xenia sp.
Pita DNA hasil ampilifikasi pada Sarcophyton trocheliophorum.
Pita DNA hasil ampilifikasi pada Sinularia peculiaris.
Pita DNA hasil ampilifikasi pada Lobophytum pauciflorum Hasil pita paling baik ditunjukan pada sampel karang lunak Xenia sp.
dan Lobophytum pauciflorum (Gambar 1 a dan .
Hal ini ditunjukan dengan tebal dan tegasnya pita DNA yang dihasilkan.
Menurut Sauer et al, 1998 kualitas DNA yang baik yaitu pita DNA menunjukan pita yang tegas, tebal .
erat molekul yang tingg.
dan tidak ada atau sedikit DNA yang smear jika di dalam pengamatan menggunakan sinar ultraviolet menggunakan UV Pita Tegas dan sedikit tebal akan dipengaruhi oleh konsentrasi DNA yang dihasilkan pada ekstraksi.
Konsentrasi yang telalu banyak akan sulit dibedakan penampakan pita DNA, sedangkan konsentrasi DNA terlalu kecil akan berdampak pada pita DNA yang tipis atau bahkan tidak dapat terlihat ketika disinari sinar ultraviolet.
KESIMPULAN
Hasil ekstraksi setelah di ujikan pada nanodrop spektrofotmeter menunjukan bahwa sampel karang lunak jenis Xenia sp memiliki konsentrasi DNA yang tertinggi dengan nilai 53.
g/u.
dan terendah pada jenis Sarcophyton trocheliophorum sebesar 26.
g/u.
Tingginya konsentrasi DNA pada karang lunak jenis Xenia sp.
dimungkinkan karena dari karakter tissue karang ini yang lebih lunak sehingga mudah di ekstraksi sedangkan rendahnya konsentrasi DNA ini dimungkinkan karena adanya kontaminasi pada hasil ekstraksi.
Optimalisasi PCR menghasilkan hasil yang baik pada spesies Xenia sp.
, dan Lobophytum pauciflorum sedangkan DOI: https://doi.
org/10.
31186/jenggano.
E-ISSN: 2527-5186.
P-ISSN: 2615-5958
Jurnal Enggano Vol.
No.
September 2022: 175 - 182 pada sampel jenis Sarcophyton trocheliophorum pita DNA menunjukan hasil yang smear.
DAFTAR PUSTAKA